麻黃水提物減輕脂多糖誘導急性肺損傷的作用及機制研究

苑 萌，董慧文，劉佳麗，馮學輝，韓寶華，韓樹池*，張志斌，盧 晶

河北北方學院附屬第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是在嚴重感染、休克、創(chuàng)傷等非心源性疾病過程中由肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成的彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，臨床上以進行性低氧血癥和呼吸窘迫為主要表現(xiàn)，具有病死率高、救治難度大的特點[1-2]。 相關(guān)的分子生物學研究顯示，活性氧（reactive oxygen species, ROS）/硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）/Nod 樣受體蛋白3（Nod like receptor protein 3, NLRP3）通路介導的炎癥反應、氧化應激反應在多種ALI 模型中與肺損傷加重有關(guān)[3-4]。 麻黃是具有抗炎、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)等活性的藥物，相關(guān)的動物實驗證實麻黃水提物對藥物性腎損傷、藥物性肝損傷具有保護作用，并且其臟器保護作用與抑制炎癥反應及氧化應激有關(guān)[5-6]。 為深入認識麻黃水提物在ALI 中的治療價值，本文以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）誘導ALI 大鼠為對象，研究麻黃水提物通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路減輕ALI 的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 雄性大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為[SCXK(京)2016-0011]，8 周齡，體質(zhì)量240～260 g，共72 只。 飼養(yǎng)條件：12 h 晝夜交替，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%。實驗過程遵循3R 原則。動物實驗在河北北方學院實驗動物中心開展，使用許可：SYXK（冀）2019-004。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：HBNV202307012098）。

1.2 藥品及試劑

LPS（批號：82857-67-8）購自美國Sigma 公司；麻黃水提物由醫(yī)院藥劑科制備；ROS/NLRP3 激動劑三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide, TMAO）（批號:1184-78-7）購自美國MCE 公司；白細胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（批號：SP12250）購自武漢賽培生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde, MDA）、總抗氧化力（total antioxidant capacity, T-AOC）及ROS 檢測試劑盒（批號分別為SP30131、SP15821、SP13358）購自武漢賽培生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin, HE）染色試劑盒（批號：G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；TXNIP、NLRP3 特異性一抗（批號：ab263899）及β-actin 特異性一抗（批號：ab8226）購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、給藥及脂多糖誘導肺損傷 實驗動物分為正常對照組、模型組、麻黃水提物組、TMAO 組、麻黃水提物+TMAO 組，每組8 只。每組均在造模前進行灌胃給藥，方法如下：正常對照組、模型組給予1 mL/100 g 生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d；麻黃水提物組參照文獻[5-6]，將400 mg/kg麻黃水提物溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d；TMAO 組參照文獻[4]，將100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1次，連續(xù)10 d；麻黃水提物+TMAO 組將400 mg/kg 麻黃水提物和100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d。 末次給藥后24 h，除正常對照組外，其余各組均參照文獻[7]進行LPS 誘導ALI 造模，方法如下：腹腔注射0.5 mL LPS 溶液、劑量5 mg/kg，復制LPS 誘導ALI 模型，正常對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 標本取材及保存 造模后6 h， 采用斷頭法處死大鼠，于斷頭處留取外周血8 mL，3 000×g 離心5 min，分離血清并在-80 ℃儲存。 剪開大鼠胸部皮膚暴露胸腔，分離并結(jié)扎右側(cè)支氣管，從左側(cè)主氣管注入磷酸鹽緩沖液，觀察到肺部膨隆后抽回液體，重復操作3 次，合并3 次回抽的緩沖液，250×g 離心10 min，分離上清作為肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF），放入-80 ℃儲存。 取右側(cè)肺組織，生理鹽水清洗后，一部分在4%多聚甲醛中固定、制作石蠟切片，另一部分在液氮中冷凍后放入-80 ℃儲存。

1.3.3 肺組織病理改變的檢測 取肺組織的石蠟切片，按照HE 染色試劑盒的說明書進行染色操作，封片后在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.4 細胞因子含量的檢測 取血清樣本和BALF樣本，按照酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒進行操作，檢測IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量。

1.3.5 氧化應激指標及ROS 活力的檢測 取液氮冷凍的肺組織約30 mg，加入生理鹽水200 μL，研磨后將組織研磨液在4 ℃以12 000×g 離心10 min，取上清并按照試劑盒的說明書進行操作，檢測MDA、T-AOC 的含量及ROS 的活力。

1.3.6 蛋白表達的檢測 取液氮冷凍的肺組織約30 mg，加入200 μL 裂解液，勻漿提取組織蛋白并檢測濃度，將含有30 μg 蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中進行Western blot 實驗。 電泳分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，用TXNIP 一抗（1∶600 稀釋）、NLRP3 一抗（1∶400 稀釋）、TXNIP 一抗（1∶250 稀釋）、β-actin 一抗（1∶5 000 稀釋）4 ℃孵育硝酸纖維素膜過夜。 次日，用辣根過氧化物酶二抗（1∶2 000 稀釋）室溫孵育硝酸纖維素膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）內(nèi)顯影得到蛋白條帶，計算蛋白條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算TXNIP、NLRP3 的蛋白表達水平。

1.3.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織病理改變的影響

正常對照組大鼠肺組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤；模型組和TMAO 組大鼠均出現(xiàn)肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變；麻黃水提物組大鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤減少、肺泡間隔增厚改善；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變較麻黃水提物組加重。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織的HE 染色（×400）

2.2 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠BALF 中炎癥細胞分類的影響

模型組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于麻黃水提物組、低于TMAO組（P<0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠BALF 中炎癥細胞分類的比較（×106/L）

2.3 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠血清及BALF 中炎癥細胞因子的影響

模型組大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量比例均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO組大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于麻黃水提物組、低于TMAO 組（P<0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清及BALF 中炎癥細胞因子含量的比較

2.4 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織中氧化應激水平的影響

模型組大鼠肺組織中MDA 的含量高于對照組，T-AOC 的含量低于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠肺組織中MDA 的含量均低于模型組、T-AOC 的含量高于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠肺組織中MDA 的含量高于模型組、T-AOC 的含量低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織中MDA 的含量高于麻黃水提物組、低于TMAO 組，T-AOC 的含量低于麻黃水提物組、高于TMAO 組（P<0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠肺組織中氧化應激水平的比較

2.5 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織中ROS/TXNIP/NLRP3 通路的影響

模型組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3的表達水平均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠肺組織中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平高于麻黃水提物組、低于TMAO 組（P<0.05）。 詳見圖2 和表4。

表4 各組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3表達水平的比較

圖2 各組大鼠肺組織中TXNIP、NLRP3 的蛋白表達

3 討論

ALI 是臨床常見的呼吸系統(tǒng)危重癥，系有非心源性因素引起的急性呼吸窘迫，表現(xiàn)為頑固性低氧血癥，嚴重者可發(fā)展為多器官功能障礙，甚至死亡。從分子生物學機制分析，該病是失控性炎癥反應引起的急性肺組織病理損傷，其特征為炎癥細胞在肺內(nèi)大量浸潤、炎癥介質(zhì)過度釋放，同時伴有ROS 大量產(chǎn)生、氧化應激反應激活[8-9]。 因此，針對ALI 的炎癥反應和氧化應激反應進行抗炎及抗氧化治療，對減輕肺損傷、降低死亡率具有積極意義。

麻黃是麻黃屬植物草麻黃、中麻黃、木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖，其水提物具有抑制炎癥反應、清除氧自由基、調(diào)節(jié)免疫應答等作用[10-11]，用于藥物性肝損傷及腎損傷動物模型的治療，起到臟器保護作用，并減輕炎癥反應和氧化應激反應[5-6]。 LPS 誘導ALI 是研究ALI 常用的動物模型[12-13]，本研究在LPS 誘導ALI 大鼠中觀察麻黃水提物減輕ALI 的治療效果。結(jié)果顯示：腹腔注射LPS 后模型大鼠出現(xiàn)了肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變，符合ALI特征，表明造模成功；經(jīng)麻黃水提物干預后，肺組織的病理改變明顯減輕，提示麻黃水提物對LPS誘導ALI 具有一定保護作用。

麻黃水提物的腎臟保護作用和肝臟保護作用與抑制炎癥反應和氧化應激反應有關(guān)。 ALI 發(fā)生及進展過程中炎癥反應激活的特征是中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在肺內(nèi)浸潤增多，多種炎癥細胞因子如（IL-1β、IL-18、TNF-α）釋放增加。 因此，檢測炎癥細胞數(shù)目及炎癥細胞因子含量能夠反映ALI 進程中炎癥反應的程度[14-15]。 氧化應激反應激活的特征是ROS 生成增多，引起脂質(zhì)損傷并生成產(chǎn)物MDA，同時消耗多種抗氧化物并引起T-AOC降低，檢測ROA 及MDA、T-AOC 能夠反映ALI 進程中氧化應激的程度[16-17]。 本研究中，LPS 誘導ALI 大鼠的BALF 中炎癥細胞數(shù)量、血清及BALF中炎癥細胞因子含量、肺組織中ROS 及MDA 含量均增加，而T-AOC 含量降低，符合炎癥反應及氧化應激反應激活的ALI 特征。 經(jīng)麻黃水提物干預后，炎癥細胞數(shù)量、炎癥細胞因子及ROS、MDA 含量降低，T-AOC 含量增加，提示麻黃水提物用于LPS 誘導ALI 的治療對炎癥反應和氧化應激反應具有抑制作用。

多項研究表明，ROS/TXNIP/NRLP3 在肺炎、ALI、膿毒癥等模型中與炎癥反應、氧化應激反應的調(diào)控密切相關(guān)[18-19]。 ROS 不僅具有氧化活性，能直接介導氧化應激，導致組織的氧化損傷，還可促進TXNIP的表達，TXNIP 能激活NLRP3 炎癥小體并引起下游多種炎癥因子的成熟和釋放，進而介導炎癥反應的級聯(lián)放大激活。 本研究中，模型組大鼠肺組織中TXNIP、NLRP3 的表達均增加；經(jīng)麻黃水提物干預后，肺組織中TXNIP、NLRP3 的表達均能降低。 TMAO是ROS 激活劑，本研究單獨使用TMAO 干預后進行LPS 誘導ALI 造模，與模型組比較，TMAO 組各項指標差異不顯著，提示模型組大鼠體內(nèi)ROS/TXNIP/NLRP3 通路已處于充分激活狀態(tài)，加用TMAO 并不會進一步激活該通路，這一結(jié)果與國內(nèi)王亞靜在重癥肺炎大鼠中的研究結(jié)果接近[4]；而與僅接受麻黃水提物干預的大鼠比較，經(jīng)麻黃水提物與TMAO 聯(lián)合干預后大鼠的肺損傷明顯加重，炎癥反應及氧化應激反應也發(fā)生激活，提示麻黃水提物干預減輕LPS 誘導ALI 的作用與抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有關(guān)。

綜上所述，麻黃水提物能減輕LPS 誘導ALI、抑制肺部炎癥反應和氧化應激，其機制可能與抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有關(guān)。麻黃水提物的生物學作用多樣且復雜，是否還通過其他分子通路發(fā)揮減輕ALI 的作用尚不清楚，故而后續(xù)進一步探索其他信號通路在麻黃水提物減輕ALI 中的作用，有助于更全面地認識該藥物的治療價值及機制。