GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 結合網絡藥理學探討地錦草藥效物質基礎及其抗炎作用機制

陳迪路，姚思凡，孫伍慧，張 藝，趙碧清*，周小江，3

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.武漢市金銀潭醫院，湖北 武漢 430023；3.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，湖南 長沙 410208

炎癥是機體對感染或組織損傷做出的天然防御機制，是一個復雜的病理過程[1]，疼痛、發紅、發熱、腫脹和浮腫是炎癥的基本癥狀[2]。 機體免疫像一把“雙刃劍”：一方面，可以防御機體免受感染等刺激帶來的損傷，有助于疾病的痊愈；另一方面，控制不當則會對機體功能造成損傷[3]。 非甾體抗炎藥常用于治療炎癥，但長期使用這些藥物會導致胃腸道潰瘍、腎功能不全和出血[4-5]。 現代研究表明，中藥憑借其多成分、多靶點的特點，在抗炎方面發揮重要的作用[6-7]。因此，從中藥中尋找療效顯著、不良反應小的炎癥抑制劑具有重要意義。

地錦草現收載于《中華人民共和國藥典》2020年版，為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦Euphorbia maculate L.的干燥全草，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的功效[8]，臨床上用于治療痢疾、泄瀉、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等，具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用。 其化學成分主要為黃酮類、三萜類、鞣質及酚酸類化合物[9]。 其中，槲皮素、山柰酚等黃酮類和棕櫚酸等酚酸類成分均具有抗炎活性[10-12]。 研究發現，地錦草總黃酮可保護膿毒癥大鼠的腸道屏障功能，降低炎癥反應及氧化應激反應的發生，控制炎癥并發癥的發生及發展[13-15]。 然而，關于地錦草化學成分種類，尤其是體內抗炎活性物質的研究較少，其藥效物質基礎尚不明確。

網絡藥理學以系統生物學的理論為基礎，通過多成分、多靶點、多通路的角度闡述藥物與疾病的關聯性，對中藥物質基礎、作用機制研究的發展起到了重要作用[16-18]。 本研究采用GC-MS、UPLC-Q-TOFMS/MS 分析地錦草的化學成分，采用網絡藥理學探究其活性成分抗炎作用的靶點和通路，為地錦草這一藥用資源的合理開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Sciex ExionLC AD 液相色譜儀（美國SCIEX 公司）；SCIEX X500R QTOF（美國SCIEX 公司）；ISQTM 7000 氣相色譜質譜聯用儀（德國賽默飛世爾科技公司）；TRACE 1300 氣相色譜儀（德國賽默飛世爾科技公司）；CP214 分析天平（美國奧豪斯公司）；SorvaLL ST8R 高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

地錦草采于湖南中醫藥大學周邊，經湖南中醫藥大學許光明教授鑒定為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.的干燥全草。色譜甲醇購自德國默克公司（批號：I1099407026）；色譜甲酸購自德國CNW 公司（批號：71140180）；純凈水購自華潤怡寶飲料有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 數據庫與軟件

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP,https://tcmspw.com/index.php）；PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/）；DrugBank 數據庫（http://go.drugbank.com）；DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/home/）；STRING 11.5數據庫（https://cn.string-db.org/）；DAVID 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.9.0 軟件。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取地錦草藥材適量，加10 倍量70%乙醇，浸泡1 h 后回流提取1.5 h，冷卻過濾后再加8 倍量70%乙醇，提取1 h，過濾，合并2 次濾液，濃縮至無醇味，備用。

2.1.1 GC-MS 溶液制備 將提取后的樣品用石油醚萃取，充分搖勻靜止后，取石油醚層，減壓干燥得浸膏。 精密稱取0.266 5 g 地錦草石油醚層浸膏，用石油醚溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半徑6 cm 條件下離心15 min，取上清液分析。

2.1.2 LC-MS 溶液制備 將提取后的樣品用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取，減壓干燥得浸膏。 分別精密稱取0.2 572 g、0.2 391 g，用色譜甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半徑6 cm 條件下離心15 min，取上清液分析。

2.2 GC-MS 條件

2.2.1 色譜條件 以Thermo scientific TG-5SILMS GC Column（30 m×0.25 mm×0.25 μm）型色譜柱為固定相，進樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；不分流進樣；進樣體積為1.0 μL；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持4 min。

2.2.2 質譜條件 EI 源(70 eV)，質譜轉換線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃，全程掃描，掃描間歇0.2 s，質量范圍45～350 m/z。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）色譜柱，流動相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～25 min，10%～30% B；25～26 min，30%～50% B；26～35 min，50%～65% B；35～36 min，65%～85% B；36～50 min，85%～100% B；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL；流速0.3 mL/min。

2.3.2 質譜條件 離子化模式為電噴霧正、 負離子模式，各化合物IDA 模式母離子多重離子掃描，一級錐孔電壓分別為80 V、-80 V，碰撞電壓分別為10 V、-10 V，一級質譜母離子掃描范圍為100～1 000 m/z。

2.4 基于網絡藥理學預測地錦草抗炎作用機制

基于GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析得到地錦草化學成分信息，結合TCMSP 和地錦草相關文獻，采用PubChem 數據庫獲取化合物的結構圖，將所獲取的化合物結構導入Swiss Target ADME 數據庫篩選其活性成分。 篩選標準：腸胃吸收（gatrointesti nal absortion；GIabsortion）為“high”；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 結果中有2 個及2 個以上為“yes”[19]。采用SwissTargetPrediction 數據庫預測成分靶點，合并去重后獲得地錦草成分靶點。 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 個數據庫中搜索“anti-inflammatory”“inflammation”，獲得與之相關的基因，合并數據庫的查找結果并刪除重復靶點，所得靶點即為相關靶點。將成分靶點和疾病靶點取交集，獲得交集靶點。 將交集靶點導入STRING 數據庫，獲得靶點間相互作用關系并導入Cytoscape 3.9.0 軟件，構建PPI 網絡，對各靶點網絡特征進行分析，以度值（Degree）、介數中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值進行篩選，獲得核心靶點，采用DAVID 6.8數據庫對靶點進行GO 生物過程富集分析和KEGG通路分析。 最終，構建地錦草抗炎作用的“活性成分-核心靶點-通路”關聯網絡。

3 結果

3.1 地錦草化學成分鑒定

3.1.1 GC-MS 分析結果 通過Thermo Chromeleon數據分析軟件結合NIST14 標準質譜庫和相對保留指數，對總離子流圖中的各峰進行分析，以面積歸一化法測得地錦草石油醚層中各組分相對質量分數，結果共鑒別出50 個化合物。 詳見圖1 與表1。

表1 地錦草GC-MS 化學成分分析鑒定

圖1 地錦草石油醚層GC-MS 總離子流圖

3.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析結果 采用UPLCQ-TOF-MS/MS 技術分別對地錦草中的乙酸乙酯和正丁醇部位的化學成分進行定性分析，正、負離子模式下的總離子流圖見圖2。通過一級和二級質譜信息分析并結合相關文獻，從地錦草圖譜中共鑒定出76個化學成分，主要為黃酮類、有機酸類成分。 詳見表2。

表2 地錦草UPLC-Q-TOF-MS 化學成分分析鑒定

圖2 地錦草UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析的總離子流圖

3.2 基于網絡藥理學的地錦草抗炎作用機制預測結果

3.2.1 地錦草有效成分的獲得 基于“2.4”項下的篩選原則，共篩選獲得活性成分12 個。詳見表3。進一步采用SwissTargetPrediction 數據庫預測，獲得成分靶點1 001 個，刪除重復靶點后共得到成分靶點214 個。

表3 地錦草有效成分信息

3.2.2 疾病靶點的獲得 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 個數據庫中搜索“Anti-inflammatory”“Inflammation”，獲得與之相關的靶點，合并數據庫的查找結果，并刪除重復項后得到10 688 靶點。 將成分靶點和疾病靶點取交集，獲得交集靶點198 個，作為地錦草抗炎作用的潛在靶點。 詳見圖3。

圖3 成分靶點與疾病靶點韋恩圖

3.2.3 PPI 網絡的構建及核心靶點篩選 將交集靶點導入STRING 11.5 數據庫，獲得靶點間相互作用關系，保存為TSV 文件。 進一步將數據導入Cytoscape3.9.0 軟件，構建PPI 網絡。 詳見圖4。 對各靶點網絡特征進行分析，以度值（Degree）、介數中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值進行篩選，其中Degree>318.548 2，Betweenness>257.126 9，Closeness>0.002 2，篩選出37 個靶點。其中，排名靠前的蛋白激酶B 1（kinases-protein kinase B 1, Akt1）、表皮生長因子受體A（epidermal growth factor receptor A, EGFRA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、SRC、ESR1、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、環氧合酶2（cyclooxygenase-2,PTGS2）、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARG)可能為地錦草抗炎作用的關鍵靶點。

圖4 交集靶點的PPI 網絡

3.2.4 富集分析及成分靶標通路功能網絡的構建 采用DAVID 6.8 數據庫對地錦草抗炎的37 個核心靶點進行功能注釋分析（GO 分析），包含生物學過程（bioprogress, BP），細胞組分（cell components, CC）和分子功能（molicular function, MF）3 個方面，選取其P 值最小的前10 個數據進行可視化處理，見圖5A。DAVID 網站分析共得到66 條KEGG 通路，選取P值最小的且與炎癥密切相關的前10 個通路進行可視化處理，見圖5B。結果表明，與地錦草抗炎作用密切相關的信號通路主要包括磷脂酰肌-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B, PI3K/PKB）信號通路、Ras 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號通路、鈣信號通路、Ras 相關蛋白1（Rasrelated protein 1, Rap1）信號通路等。將KEGG 通路圖進行深度分析和整合，構建抗炎調控機制圖，詳見圖6。

圖5 GO(A)和KEGG(B)富集分析結果

圖6 地錦草抗炎調控機制圖

4 討論

GC-MS 聯用儀具有靈敏度好、分辨率較好、有標準質譜庫等優點，適合中藥樣品中復雜的揮發性成分分析，鑒定化合物快捷且簡便[20-21]。 結果顯示，地錦草石油醚層共鑒定出50 個化學成分，揮發性主要成分為酸類、酯類、酮類等物質，主要揮發性成分為棕櫚酸等[22]。 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術共從地錦草乙酸乙酯和正丁醇提取物中鑒定出76 個化學成分，主要為黃酮類、有機酸類成分[23-24]。

近年來，網絡藥理學在中藥及復方有效成分篩選、靶點及通路的預測方面得到了廣泛應用[25-26]。 通過網絡藥理學預測中藥活性成分、作用靶點及作用通路，能夠節約藥物開發成本，同時也為中藥的機制研究提供新思路[27-28]。 本研究通過地錦草“活性成分-靶點-通路”網絡，挖掘地錦草抗炎作用的關鍵作用靶點，探索潛在的抗炎機制。 黃酮類和酚酸類化合物是地錦草中主要化學成分，大量研究表明，此類化合物具有抗炎作用。 本研究篩選出的12 個活性成分，也主要為黃酮類成分，具體包括鞣花酸、山柰酚、芹菜素、槲皮素、柚皮素、木犀草素等。 網絡藥理學篩選得出的部分化合物未能采用質譜從植物中鑒定，可能與化合物在地錦草中含量較低，以及提取時的溶劑極性、溫度等不符有關，但其類藥性和口服生物利用度均高于其他被鑒定出來的提取物。且由于這些高活性化合物在低濃度下也有顯著的藥理活性，故結合TCMSP 數據庫，將這些成藥性較高，但含量較低的化合物納入了網絡藥理學研究。

地錦草抗炎作用的核心靶點包括KT1、EGFR、VEGFA、SRC、ESR1、ERBB2、PTGS2、PPARG 等。 據文獻報道，槲皮素可以負調節巨噬細胞介導的體外炎癥反應和脂多糖誘導的腹膜炎，對炎癥介質的釋放以及SRC 的酶活性具有抑制作用[29]。 芹菜素可提升肺炎鏈球菌腦膜炎大鼠神經系統評分，減輕炎癥反應，抑制大鼠腦組織細胞凋亡，對肺炎鏈球菌腦膜炎大鼠腦損傷起保護作用[30]。 鞣花酸可以明顯改善腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障、腦組織損傷、運動和探索行為，有效抑制炎癥反應[31]。 此外，鞣花酸還能夠修復腸黏膜屏障，抑制NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 炎癥小體活化，下調胱天蛋白酶-1表達水平，顯著改善脂多糖誘導的小鼠急性腸道炎癥[32]。結合文獻及網絡藥理學結果表明，地錦草中的黃酮類成分芹菜素、槲皮素、木犀草素等，以及鞣花酸等多酚類化合物可能為抗炎的關鍵成分，VEGFA、SRC、ESR1 等可能為抗炎的關鍵靶點。

根據KEGG 分析，地錦草抗炎作用與PI3K/Akt、ErbB、VEGF、甲狀腺激素、雌激素等信號通路有關。PI3K/Akt 信號轉導通路是經典的調控細胞分化、促細胞存活、抗細胞凋亡的通路，Akt 是PI3K/Akt 信號通路的關鍵環節，PI3K/Akt 信號通路對多種生命活動的調控均有賴于Akt 的磷酸化[33]。PI3K/Akt 信號通路參與NDMA 誘導的肺纖維化的病因，通過PTEN介導抑制PI3K/Akt、NF-κB 和MDM2-p53 信號通路，發揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[34]。研究發現，木犀草素以劑量依賴方式抑制Akt 的磷酸化，減輕脂多糖誘導的炎癥反應， 通過NF-κB/AP-1/PI3K/Akt信號通路顯著抑制NO 和PGE-2 的產生[35]。VEGFA能夠介導炎性細胞的募集，并增強募集和駐留的單核細胞上共刺激分子的表達[36]。研究表明，槲皮素可以減輕膠原誘導性關節炎大鼠關節炎癥，提高對關節軟骨和骨的保護作用，通過抑制膠原誘導性關節炎大鼠關節滑膜VEGFA 的表達，發揮抗血管新生作用[37]。本研究結果提示，地錦草可能通過作用于關鍵靶點，調控以上信號通路發揮抗炎作用。

地錦草通過多成分、多靶點、多通路的協同作用發揮抗炎作用，為后續地錦草抗炎作用的靶點和通路研究奠定基礎，為其深入研究與應用提供了科學依據和數據支撐，對深入闡述中藥的活性成分、藥效學作用及相關機制具有重要作用。 今后可以加強藥理學實驗，驗證地錦草對關鍵靶點的調節作用以及藥物對機體的免疫調節作用。