養陰涼血方對過敏性紫癜患兒血清誘導內皮細胞損傷的保護作用

何 分,史艷平,李 霞,趙珍珍,邱 銳,趙愛霞

(1.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046;2.西安市兒童醫院,陜西 西安 710003)

作為一種兒童血管炎最常見形式且易累及全身細小動脈和毛細血管的血管變態反應性疾病,過敏性紫癜(Henoch-schnlein purpura,HSP)目前發病率為十萬中約有18.6人患病[1]。研究顯示,過敏性紫癜在學齡期兒童中發病率越來越高,且男童發病率高于女童,發病時間多為秋冬交替之季[2],對兒童有嚴重的健康風險。HSP發病因素復雜,危險因素包括感染、遺傳、疫苗接種、食物及藥物等,但其確切病因和發病機制目前仍處于探索中[3]。有研究表明在HSP病程急性期,患兒的血清可刺激內皮細胞分泌合成多種炎性因子,導致血管受損,其在過敏性紫癜患兒發病機制中發揮關鍵性作用[4]。另有學者認為在遺傳與環境因素的作用下,機體免疫紊亂也參與了HSP發病,尤其是免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA),IgA類免疫復合物沉積及異常糖基化等均提示其在HSP的發生發展中發揮不可替代的作用[5]。研究發現髓樣IgA Fc受體(FcαRI/CD89)在HSP及紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis,HSPN)患兒腎活檢表達中均明顯升高,提示CD89參與HSP及HSPN的發病[6]。內皮細胞也稱血管內皮細胞,是形成血管內壁的一層高度分化的單細胞層,具有吞噬和免疫作用,內皮細胞在各種致病因素影響下發生損傷是包括過HSP在內的多種血管炎發病的關鍵環節。有研究指出內皮細胞損傷與HSP發病密切相關[7]。相關實驗也表明,內皮細胞損傷后分泌的細胞因子可通過激活補體系統、調節機體免疫功能、參與炎癥反應等促進過敏性紫癜的發生發展[8]。故選擇性保護血管內皮細胞、調控血管內皮細胞的炎癥反應以及血管內皮細胞的靶向治療也給予HSP的預防和治療一種新的干預手段和思考方向。中醫認為過敏性紫癜屬“血證、斑疹、肌衄、紫癜風”之類[9]。有關紫癜風中醫證型分布研究結果顯示,血熱妄行證為學齡期兒童患過敏性紫癜最主要的證型[10]。治以清熱涼血、益氣攝血、滋陰降火等。中醫中藥治療過敏性紫癜的道路始終在不斷發展及創新。西安市兒童醫院史艷平主任醫師基于多年臨床經驗,所自擬經驗方養陰涼血方在過敏性紫癜治療中取得較好療效,但具體作用機制尚不清楚。基于此,本實驗項目以人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical venous endothelial cells,HUVECs)為研究對象,利用過HSP患兒血清刺激HUVECs而誘導的過敏性紫癜模型,同時加入不同濃度的養陰涼血方進行保護,通過此種方式研究觀察養陰涼血方對血管內皮細胞的保護作用并探討其可能治療機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2022年6月至2022年12月收治于西安市兒童醫院中西醫結合科明確診斷為過敏性紫癜,且中醫辨證屬血熱妄行證患兒30例,其中男16例,女14例,平均年齡(7.1±2.0)歲。正常對照組則搜集同時期就診于西安市兒童醫院門診體檢科、年齡相仿的健康兒童30例,男16例,女14例,平均年齡(7.0±2.3)歲。

西醫診斷標準： 參照2005年歐洲風濕病協會修訂的過敏性紫癜診斷標準[11]及《諸福棠實用兒科學》[12]中過敏性紫癜診斷標準。中醫診斷標準：符合《過敏性紫癜中醫診療指南》[13]中血熱妄行證診斷標準：明確診斷為過敏性紫癜,皮膚瘀點密集,甚至成片,色澤鮮紅。可伴有面赤、心煩、大便干燥、發熱,部分患兒伴有腹痛及關節腫痛。病例納入標準：符合診斷標準;年齡3～12歲的初診者;病程1～7 d。排除標準：非首次發病或發病時間超過1周;對本次治療藥物過敏者;已接受相關藥物治療(如免疫抑制劑、糖皮質激素類等);合并心、肝、腎等系統嚴重疾病。

1.2 細胞、主要試劑、儀器和藥物 HUVECs購自上海市東方醫院GMP實驗室(國家干細胞庫)。抗體AKT(MC010);PI3K(sc-365290);P-PI3K(ab191606);人TNF-α、IL-8、IgA、CD89檢測試劑盒(上海西唐);電泳槽(型號JY-SCZ2+);電泳儀(JY300HC);生物酶標儀(ELX800);高速冷凍離心機(湘長設備,D170302);熒光顯微鏡(CKX53);養陰涼血方的藥物組成為水牛角、茜草各10 g,生地8 g,板藍根、金銀花各6 g,玄參、白芍、甘草各5 g,川芎、白花蛇舌草、丹皮各4 g,均為藥物顆粒劑,該方中所需中藥顆粒劑購自三九集團,取藥物顆粒制劑用熱水混合,完全融化后靜待10 min,濃縮及過濾除菌后,得到濃度為0.5、1 g/ml的藥液,置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備血清：符合納入標準入組病例兒童于空腹采外周靜脈非抗凝全血2 ml,置于常溫條件下靜放2 h,用高速離心機離心15 min后提取血清,分裝于EP管,每管200 μl,并做好相關規范標識,置于-80 ℃超低溫冰箱中備用。以上過程均需保證無菌操作。

1.3.2 HUVECs的培養：首先在1640培養基(含青霉素/鏈霉素,10%胎牛血清)中將細胞株復蘇培養,再放入37 ℃,含5% CO2的恒溫培養箱中培養傳代。根據細胞生長狀況,選取細胞進行以下實驗研究。

1.3.3 細胞分組：①空白對照組：HUVECs;②HSP組：HUVECs+2 g/ml HSP血清;③養陰涼血方低濃度組：HUVECs+2 g/ml HSP患兒血清+養陰涼血方(濃度為0.5 g/ml);④養陰涼血方高濃度組：HUVECs+2 g/ml HSP患兒血清+養陰涼血方(濃度為1 g/ml);⑤正常對照組：HUVECs+2 g/ml健康兒童血清。

按每孔106個細胞將分化成熟的HUVECs接種于6孔培養板中,每孔體積2 ml,置于細胞培養箱(37 ℃,5%CO2)中培養,待細胞長至部分融合后,每孔用PBS緩沖液清洗2遍。除空白對照組及正常對照組外,余各組加入2 g/ml HSP血清造模,干預24 h后,按照分組要求加入養陰涼血方治療24 h。

1.3.4 ELISA法檢測HUVECs中TNF-α、IL-8、IgA、CD89含量：末次給藥后,繼續培養24 h后收集上清液。按照試劑盒說明書步驟進行操作,結束后立即測定結果,測定各孔的吸光值并繪制檢測標準曲線,計算標本TNF-α、IL-8、IgA、CD89含量。

1.3.5 Western blot檢測HUVECs中PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關蛋白表達：收集細胞,用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞,添加裂解液進行低溫裂解,提取總蛋白,BAC定量, SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉膜封閉。一抗(加入PI3K抗體)4 ℃下孵育過夜,次日與加入辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶2000) 常溫孵育1 h。在膜表面均勻滴加化學發光液,避光反應1～2 min。化學發光法檢測目的條帶,壓X線片曝光。用Image J計算條帶灰度值,蛋白質的相對含量以目的蛋白與β-actin條帶平均灰度值的比值表示,進行統計分析。

2 結 果

2.1 各組HUVECs細胞形態學變化 見圖1。空白對照組HUVECs顯微鏡下可見細胞生長形態良好,貼壁生長,呈短梭形,邊界清楚;加入正常患兒及HSP患兒血清處理之后,細胞會出現數目減少、形態皺縮;相比于正常對照組,HSP組細胞總體趨勢較差;養陰涼血方干預后,細胞數目及形態總體變化趨勢較HSP組改善,且養陰涼血方高濃度組更明顯。

圖1 各組HUVECs細胞形態學變化(×100)

2.2 各組TNF-α及IL-8水平比較 見表1。與正常對照組和空白對照組相比,HSP組HUVECs中TNF-α、IL-8含量明顯升高(P<0.05);與HSP組比較,養陰涼血方低、高濃度組HUVECs中TNF-α、IL-8含量隨著中藥濃度增大明顯降低(P<0.05)。

表1 各組TNF-α、IL-8水平比較(pg/ml)

2.3 各組IgA及CD89水平比較 見表2。與正常對照組和空白對照組相比,HSP組HUVECs中IgA、CD89含量明顯升高(P<0.05);與HSP組比較,養陰涼血方低、高濃度組HUVECs中IgA、CD89含量隨著中藥濃度增大逐漸下降(P<0.05)。

表2 各組IgA、CD89水平比較(pg/ml)

2.4 各組HUVECs中PI3K、p-PI3K蛋白表達比較 見圖2。HSP組和養陰涼血方低、高濃度組的PI3K蛋白水平與空白對照組和正常對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05),而磷酸化的PI3K(p-PI3K)水平則顯著增高(P<0.05);與HSP組比較,經不同濃度養陰涼血方干預后p-PI3K蛋白表達水平明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與HSP組比較,#P<0.05;與正常對照組比較,△P<0.05

3 討 論

過敏性紫癜現多稱為IgA血管炎(Immunoglobulin A vasculitis,IgAV),這種小血管炎的特點是可觸及的紫癜、腹痛、關節炎或關節痛和腎臟受累[14]。過敏性紫癜屬于自限性病程疾病,大多數患兒預后良好,遠期預后取決于是否并發腎臟損傷,腎臟病變常較遷延,可嚴重影響患兒生活質量,預后相對較差[15]。作為一種發病原因和發病機制尚不十分清楚的自身免疫性疾病,過敏性紫癜至今仍無理想的治療方法,且目前國內外缺乏完善、規范的診療共識。西醫學治療缺乏特異性藥物,臨床上目前常主要是控制感染,去除病因,以抗過敏藥、糖皮質激素、免疫抑制劑等為主,目的大多是有效阻斷炎癥進程,快速緩解病情,減少腎臟損害。現代醫學雖然能病理性抑制疾病,短期療效雖好,但長期治療穩定性欠佳,不良反應多,且停藥后容易復發,同時給患兒及家長帶來較大的心理、經濟負擔。中醫學認為小兒為“純陽之體”,外邪入侵易趨化熱,血受寒則凝,受熱則行,絡傷血溢則成病,血溢肌膚,則外見紫癜。中醫藥治療本病根據疾病所處階段整體審查、全面判斷并制訂合理的診療方案,療效確切,且不良反應少,增強機體免疫力,減少腎臟損害及復發[16]。中醫學對其獨特的認識和治療優勢,未來治療發展方面,隨著其理論和治療手段不斷發展完善,與西醫協同增效,力求為每一位紫癜患兒提供規范化、個體化的診療,提高患兒生活質量。

綜合過敏性紫癜病因病機在古今文獻記載及臨床觀察研究發現,紫癜風的病因病機主要與“風、熱、毒、濕、瘀、虛”等因素相關,而導致過敏性紫癜病情反復、遷延難愈的重要病因則為血熱和血瘀,并且血熱及血瘀貫穿該病病程始終,故應針對相關病因及癥狀進行對癥治療。本實驗中所選取的養陰涼血方對于兒童過敏性紫癜的臨床癥狀有較好的改善作用,提高臨床療效,縮短疾病病程,減少腎臟損害及復發。該方以養陰清熱、涼血解毒為治療原則,方中水牛角、茜草共為君藥,發揮清熱涼血散瘀等作用。現代藥理研究表明[17],水牛角水解物能縮短出血時間、降低毛細血管通透性、升高血小板而呈現明顯的止血作用,對血管具有良性調節保護。而茜草味苦性寒,善走血分,既能涼血止血,又能化瘀止血,有助于皮膚紫癜消退等方面的治療。臣以甘寒質潤的生地黃與玄參,兩者均能清熱涼血,養陰生津。常相須為用。同時板藍根和金銀花清熱解毒也作為臣藥則起到輔助作用,隨著藥理學研究深入,金銀花在抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化活性、抗凝血、保肝護肝等方面都有很好的效果[18]。佐以“血中氣藥”川芎,既能活血祛瘀,又能行氣,善通達氣血。佐以白芍補血養血,補益虛勞。佐以臨床上清熱解毒的抗炎良藥之白花蛇舌草,最后佐以牡丹皮清熱涼血,活血化瘀。使以甘草調和諸藥,兼顧護脾胃。全方藥簡力專,切中紫癜風病的病因病機,集涼血、活血、養血三法之組合,諸藥相配,標本兼治,療效顯著。

IL-8作為一種炎癥趨化因子,其對機體產生的免疫作用具有雙向性。在多種炎癥疾病的發生發展過程中作為不容忽視的重要介質而發揮抗感染、抗腫瘤以及免疫調節等重要功能。IL-8在內皮細胞、中性粒細胞、單核細胞等多種細胞中均可表達,存在促進炎性反應等作用。有研究顯示[19],在過敏性紫癜患兒病程的急性期,白細胞會升高,出現多核白細胞浸潤血管的周圍,激活內皮細胞產生較多的IL-8, 同樣的,IL-8不斷增加也促使白細胞聚集于血管周圍,釋放出較多蛋白酶,導致血管出現炎性損傷。有研究發現[20]急性期過敏性紫癜患兒血清中IL-8表達異常升高,并多由內皮細胞損傷分泌產生。腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α)一方面可誘導其他炎癥因子合成及釋放,導致局部組織炎癥的發生發展,另一方面也可誘導血管內皮細胞過度表達黏附分子,損傷血管內皮[21]。有研究發現[22]TNF-α可激活HUVECs 內信號通路,誘導HUVECs的凋亡,顯著增加炎癥因子表達,誘導炎癥反應,達到加重內皮細胞損傷的目的。另有實驗表明,TNF-α及其他相關炎性因子在患兒血清中的變化不僅能夠反映病情嚴重程度,也能起到評估預后的作用[23]。本實驗發現,與HSP組比較,低、高濃度中藥組HUVECs中TNF-α、IL-8含量明顯降低,且隨著中藥濃度增大含量逐漸下降。由此推測,養陰涼血方在人體內發揮減緩血管炎性反應的作用可能與抑制血管內皮細胞分泌TNF-α、IL-8等炎性因子有關。

IgA屬于高度糖基化的免疫球蛋白,在過敏性紫癜發病過程中發揮著關鍵作用。研究發現HSP患兒急性期血清IgA水平明顯升高[24];腎臟組織活檢可見IgA沉積[25];HSP模型組小鼠IgA異常糖基化程度顯著高于正常對照組[26],均提示IgA與過敏性紫癜存在密切的聯系。另有報道稱IgA的表達在HSP評價中意義重大,可以較好地評估腎臟功能受損害及預后情況[27]。目前已發現的IgA受體主要有5類,作為一種髓系來源的細胞,并且廣泛表達于中性粒細胞中,FcαRI(CD89)是真正意義的IgA Fc受體,能與所有形式的IgA結合,屬于免疫球蛋白受體超家族成員,在機體免疫防御和維持系統免疫平衡方面扮演著重要的角色[28]。目前,隨著對IgA及其Fc受體的結構、功能等深入研究,其重要性也逐漸引起人們認識,孕育著人們對炎癥性疾病治療的新思路。通過研究HSP患兒皮損組織,發現CD89呈強陽性表達,提示CD89參與急性期HSP發病[6],并可能作為急性期HSP的重要分子標記[29]。本實驗發現, HSP組HUVECs中IgA、CD89表達呈升高趨勢,也提示IgA、CD89在HSP的發病過程中具有一定的作用,且低、高濃度中藥組HUVECs中IgA、CD89含量隨著中藥濃度增大逐漸下降。由此推測,養陰涼血方可能通過降低HUVECs中IgA、CD89表達,抑制人臍靜脈內皮細胞增殖發揮細胞保護作用,幫助機體恢復免疫平衡。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)/核轉錄因子κB(NF-κB)是一種能夠對下游因子進行調控,在細胞凋亡、增殖、炎性反應等生物學過程的調節中發揮重要作用的細胞內信號通路[30]。隨著分子生物學研究的深入,PI3K/AKT/NF-κB信號通路因廣泛參與細胞內信號轉導而成為研究熱點。PI3K作為一類通過磷酸化或去磷酸化在體內多個方面發揮重要作用且與細胞內信號傳導密切相關的第二信使分子[31],正常情況下以非磷酸化形式在體內存在,當被各種促炎物質活化后可發生磷酸化(p-PI3K),在免疫細胞受體激活信號傳導中發揮重要作用。研究顯示,通過降低PI3K/AKT/NF-κB信號通路上所調控的血管內皮細胞相關促炎因子的表達,可減輕HUVECs的炎癥刺激和活化作用,提高細胞活力,改善細胞形態[32]。本實驗發現,通過過敏性紫癜患兒血清誘導使HUVECs內PI3K發生磷酸化,經過養陰涼血方干預后其磷酸化水平降低。由此推測,養陰涼血方可通過某些靶基因來激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路以此來維持內皮細胞存活。

綜上所述,養陰涼血方治療過敏性紫癜效果明確,降低機體TNF-α、IL-8、IgA、FcαRI(CD89)水平,其作用強弱與養陰涼血方劑量大小呈正相關。可能的作用機制為通過抑制血管內皮細胞中PI3K蛋白的表達,進而抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路上下游相關靶基因表達,減少相關免疫因子如TNF-α、IL-8、IgA、FcαRI(CD89)的分泌,維持內皮細胞存活,從而達到免疫調節,減輕炎性反應的目的。另外,本研究相關結果也提示FcαRI(CD89)與HSP具有相關性,可能為疾病的診治提供新依據,未來有望成為重要的治療靶點,因為病例數量少,其具體作用機制尚不清楚,仍需要進一步深入研究。本實驗所選PI3K/AKT/NF-κB信號通路在許多疾病的演變過程中扮演著關鍵角色,目前研究該通路的多個關鍵蛋白靶點逐漸成為關注重點。PI3K有一個直接的下游靶點蛋白激酶B(AKT),同時AKT也可激活IκB,使IκB從NF-κB上脫落并被泛素化,使得NF-κB由抑制狀態被激活,而活化的NF-κB進入細胞核,激活靶基因釋放炎癥介質,誘發炎癥反應[33]。PI3K/AKT/NF-κB信號通路上關鍵蛋白核因子(NF-κB)與炎癥密切相關,因此,探索該相關信號通路旨在為過敏性紫癜的未來研究提供有價值的信息和思考[34]。由于本實驗時間及科研經費有限,納入樣本量略少,未能進一步探討其他客觀指標及檢測其信號通路下游相關靶基因蛋白表達水平。待今后進一步完善其信號通路下游相關靶基因蛋白表達水平檢測及延長實驗時間以進一步探討養陰涼血方治療過敏性紫癜機制。