健脾補腎益肺方減輕慢性阻塞性肺疾病小鼠氧化應激的實驗研究*

李 淵 吳崢嶸 郝素英 何 明

（北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的特征是持續存在的氣流受限和相應的呼吸系統癥狀。2018 年“中國成人肺部健康研究”調查結果顯示，我國20 歲及以上成人COPD患病率為8.6%，40歲以上人群患病率高達13.7%，估算我國COPD 患者數近1 億［1］，但我國COPD 知曉率、診斷率、治療率低［2］，故COPD 的防治是我國重要的公共衛生問題。

COPD 的發病機制復雜，吸入煙草煙霧等有害顆粒或氣體可引起氣道氧化應激、炎癥反應以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等，這些途徑參與了COPD 的發病［1］，其中氧化抗氧化失衡受到廣泛重視。Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）-核因子紅系2 相關因子2（Nrf2）-抗氧化反應元件（ARE）信號通路可調節多種抗氧化基因的轉錄［3］。中醫藥在防治COPD 中顯示出較強的優勢。本課題組在前期臨床研究中發現［4-5］，健脾補腎益肺方能改COPD 患者的肺功能、6 min 步行試驗，該方中多數中藥具有抗氧化應激的作用。為進一步研究健脾補腎益肺方對COPD 的作用機理，本研究擬觀察健脾補腎益肺方對COPD 小鼠Keap1-Nrf2-ARE 信號通路的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠7 周齡雄性30只，購自北京維通利華生物有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0006。飼養條件：清潔級，室內溫度20～25 ℃；相對濕度50%～70%。光照時間固定，每天晝夜各12 h，晝間照明時間為8∶00～20∶00。動物飲用水及籠具經高壓滅菌鍋滅菌處理，飼料及墊料均經輻照處理，水、食物自由攝取。小鼠飼養于北京中醫藥大學東方醫院實驗動物中心SPF 級動物房。適應性喂養7 d后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 健脾補腎益肺方（生黃芪30 g，太子參30 g，熟地黃15 g，黃精15 g，白果10 g，地龍15 g），中藥飲片購于北京中醫藥大學東方醫院，水煎煮提取2 次，合并提取液，濃縮得浸膏；丙卡特羅25 μg/片，浙江大冢制藥有限公司。主要試劑和儀器：脂多糖（LPS，美國Sigma 公司）；大前門香煙（上海煙草公司，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛（MAD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2一抗（PTG 16396-1-AP）；超氧化物歧化酶（SOD）一抗（PTG 10269-1-AP）；血紅素加氧酶1（HO-1）一抗（10701-1-AP）；醌氧化還原酶1（NQO1）一抗（67240-1-IG）；HRP 標記山羊抗兔通用二抗（DAKO K5007）；免疫組化試劑盒DAB 顯色劑（DAKO K5007）。電子天平稱（萬特1002）；離心機（湖南平凡科技TG16W）；氣麻機（眾實科技ZS-MV）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司RM2016）；渦旋混合器（天悅電子TYXH-Ⅱ）；顯微鏡（CIC XSP-C204）；自制透明有機玻璃煙熏箱：100 cm×100 cm×60 cm 箱，分上、下2層，底部網眼結構，上層放鼠，下層放煙。

1.3 分組與造模 將30 只小鼠按隨機數字表法分為5 組，正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，每組6 只。模型制備：參照文獻［6］，采用煙霧暴露聯合LPS 氣道內滴注造模。第1、14 日采用1.4%異氟烷吸入麻醉，4 號針頭穿刺氣管，滴注LPS 7.5 μg/50 μL。氣管滴注當天不進行煙熏。第2 至13 日，第15 至90 日將小鼠置入煙熏箱內熏煙，每日2 次，上下午各1次，上下午間隔4 h，每次2 h（間隔換氣20 min），每小時10 支煙，每周煙熏6 d。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組造模方法同模型組。正常組：不用煙熏，氣管內滴注50 μL生理鹽水。

1.4 干預方法 中藥高劑量組、中藥低劑量組從造模第2 日開始，健脾補腎益肺膏方溶于生理鹽水灌胃給藥，中藥低劑量組給藥劑量為人臨床用量的等效劑量，合生藥量為14.95 g/（kg·d），中藥高劑量組合生藥量為29.9 g/（kg·d）。第14 日不灌服，給藥至第90 日，每周稱量體重，根據體質量變化調整給藥劑量。西藥組：從造模第2日開始，給予丙卡特羅［26 μg/（kg·d）］溶于同中藥組等體積生理鹽水灌胃，第14 日不灌服，給藥至第90 日，根據體質量變化調整給藥劑量。正常組：給予同中藥組等體積的生理鹽水灌胃。

1.5 標本采集與檢測 1）各組小鼠肺功能指標測定。第91 日行肺功能檢查并處死動物留取肺組織，采用1.4%異氟烷吸入麻醉，仰臥固定于操作臺。于頸部正中剪開皮膚后逐層分離肌肉組織，暴露氣管，插入氣管插管，打結固定。將小鼠置入動物肺功能分析儀中，待小鼠與肺功能儀完全協調后，開始測定肺通氣功能。測定小鼠用力肺活量（FVC）、第0.15 秒用力呼氣容積（FEV0.15）、0.15 s 呼出容積占用力肺活量之比（FEV0.15/FVC）、用力呼出50%肺活量時的最大瞬間呼氣流量（FEF50%）、用力呼出75%肺活量時的最大瞬間呼氣流量（FEF75%）。2）各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA 測定。肺功能測定完畢之后，迅速沿胸骨打開胸腔，止血鉗夾閉左主支氣管，用1 mL 注射器吸取0.5 mL PBS 后與氣管插管相連，緩慢推注射器，待PBS 在左肺停留約10 s 后再回抽，反復抽吸3 次，回收肺泡灌洗液。在4 ℃、800 r/min 的條件下離心10 min，分離上清液放于-80 ℃冰箱保存待測。按照ELISA 試劑盒說明書檢測肺泡灌洗液中ROS、MDA 水平。3）各組小鼠肺組織病理學觀察。取各組小鼠右肺，置于4%多聚甲醛內固定，常規石蠟包埋、切片，根據HE 染色試劑盒說明書步驟HE 染色。每張切片任取5 個視野，以觀察肺部病理變化。4）各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1、Nrf2免疫組織化學檢測。將石蠟切片脫蠟至水，進行抗原修復，在切片上滴加一抗，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜。滴加免疫組化試劑盒內與一抗相應種屬的二抗（HRP 標記）覆蓋組織。滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。復染細胞核，脫水封片。顯微鏡鏡檢，采集圖像。采用圖像分析軟件Image-pro pus 6.0對圖像進行分析，以平均光密度值為指標對各組免疫組化染色進行定量分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間均數比較采用Oneway ANOVA分析，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺功能比較 見表1。與正常組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%顯著增高（P＜0.01），中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%顯著增高（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%均顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組小鼠肺功能比較（±s）

表1 各組小鼠肺功能比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.01；與中藥高劑量組比較，▲P ＜0.01。下同。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 FEV0.15/FVC%85.83±3.51 55.29±2.93*74.25±2.44*△62.41±1.02*△▲62.57±4.64*△▲FEF50%（mL/s）6.74±0.22 3.90±0.61*5.47±0.24*△4.15±0.14*▲4.11±0.49*▲FEF75%（mL/s）4.82±0.30 2.40±0.67*3.49±0.35*△2.35±0.22*▲2.37±0.42*▲

2.2 各組小鼠肺組織病理改變 見圖1。正常組：小鼠肺組織肺泡結構正常，小氣道支氣管壁正常。模型組：小鼠肺泡結構不完整，部分肺泡壁增厚，可見大量炎性細胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，肺泡腔擴大，小氣道支氣管壁增厚，氣道周圍炎癥細胞浸潤。中藥高劑量組：小鼠肺組織病理改變相對模型組改善較為明顯，絕大多數肺泡結構趨向正常。中藥低劑量組：小鼠肺組織病理改變相對模型組有所改善，部分肺泡壁增厚，可見炎性細胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，小氣道支氣管壁增厚。西藥組：小鼠肺組織病理改變相對模型略有所改善，部分肺泡壁增厚，較多炎性細胞浸潤，部分肺泡壁斷裂。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色，20倍）

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較 見表2。與正常組相比，模型組、中藥低劑量組、西藥組ROS、MDA 均顯著增高（P＜0.01），中藥高劑量組ROS顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組ROS、MDA 以及中藥低劑量組ROS 顯著減少（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組ROS、MDA均顯著增多（P＜0.01）；與中藥低劑量組相比，西藥組ROS顯著增多（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較（±s）

表2 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較（±s）

注：與中藥低劑量組比較，★P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 ROS（U/mL）5.17±1.00 17.47±1.34*8.40±1.14*△14.38±1.63*△▲16.52±2.49*▲★MDA（μmol/L）2.38±0.54 4.47±0.95*2.57±0.56△4.33±0.84*▲4.03±0.94*▲

2.4 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1 平均光密度值比較 見表3、圖2。與正常組相比，模型組、西藥組SOD 均顯著減少（P＜0.01），中藥高劑量組SOD 顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組及中藥低劑量組SOD 均顯著增多（P＜0.01 或P＜0.05）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組SOD 均顯著減少（P＜0.01）。與正常組相比，中藥高劑量組HO-1、NQO1顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組HO-1、NQO1 顯著增多（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組HO-1、NQO1 顯著減少（P＜0.01）；與中藥低劑量組相比，西藥組HO-1顯著減少（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1、Nrf2表達（免疫組織化學染色，20倍）

表3 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1平均光密度值比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1平均光密度值比較（±s）

注：與模型組比較，△△P ＜0.05。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 SOD 0.003 9±0.001 00 0.001 4±0.000 53*0.006 0±0.000 80*△0.002 7±0.000 82△△▲0.002 0±0.000 78*▲HO-1 0.002 3±0.000 80 0.002 4±0.001 50 0.006 4±0.001 10*△0.003 3±0.000 80▲0.002 1±0.000 85▲★NQO1 0.004 0±0.000 79 0.003 2±0.000 98 0.009 5±0.003 14*△0.004 2±0.000 70▲0.003 3±0.000 85▲

2.5 各組小鼠肺組織Nrf2 平均光密度值比較 見表4、圖2。與正常組相比，中藥高劑量組Nrf2 顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組Nrf2 顯著增多（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組Nrf2顯著減少（P＜0.01）。

表4 各組小鼠肺組織Nrf2平均光密度值比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織Nrf2平均光密度值比較（±s）

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 Nrf2 0.002 4±0.000 94 0.002 1±0.000 88 0.0102±0.00484*△0.0020±0.00081▲0.0028±0.00101▲

3 討 論

該研究表明，健脾補腎益肺方可改善COPD 小鼠的肺功能，改善小鼠體內氧化應激程度，通過調控Keap1-Nrf2-AER 信號通路，增強抗氧化劑的表達，從而減輕小鼠氧化應激，保護小鼠的肺功能，減輕肺氣腫程度，減少小氣道壁的炎性浸潤。COPD 發病中氧化應激機制是目前的研究熱點，有關中藥復方對COPD 小鼠氧化應激機制以及相關通路影響的研究目前還尚未深入，本研究揭示了健脾補腎益肺方可能通過調節COPD 小鼠Keap1-Nrf2-AER 信號通路從而減輕氧化應激程度。

本研究發現，健脾補腎益肺方能顯著提高COPD小鼠的FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%，提示該方可改善COPD 小鼠的肺功能。前期臨床研究［4-5］發現，健脾補腎益肺方治療組患者的FEV1%、FEV1/FVC%顯著高于正常組，提示該方可改善患者的肺功能。該方的臨床療效在動物模型上得到了驗證。健脾補腎益肺方是何明教授在多年的臨床實踐基礎上總結提煉而成的，方中太子參、黃芪補益肺氣，健脾助運，熟地黃、黃精補腎益精，白果、地龍斂肺平喘。該方主要藥物黃芪、太子參、熟地黃、黃精具有抗氧化作用［7-10］，故筆者進一步探討健脾補腎益肺方對氧化應激以及相關抗氧化通路的影響，從而揭示其抗氧化的機制，為指導中醫藥治療COPD提供更多的證據。

COPD 小鼠存在氧化-抗氧化失衡。ROS、MDA 為氧化應激的生物標志物，ROS包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫等，當ROS 生成過多時，可導致脂質、蛋白質和DNA 過氧化，MDA 是脂質過氧化的主要產物［11］。SOD、HO-1、NQO1則為重要的抗氧化劑［12］。此外HO-1 被報道是肺中的抗氧化劑，在保護肺細胞免受氧化應激及炎癥損傷方面具有重要意義［13］。研究發現，模型組小鼠ROS、MDA 比正常組均顯著增高，而模型組小鼠SOD 比正常組顯著減少，兩組HO-1、NQO1 無顯著差異，說明模型組小鼠比正常組氧化應激生物標志物明顯增多，而抗氧化劑卻減少或與正常組無差異，證實模型組小鼠存在氧化-抗氧化失衡。

健脾補腎益方可減輕COPD 小鼠的氧化應激程度。健脾補腎益肺方高、低劑量組比模型組ROS 均顯著減少，健脾補腎益肺方高劑量組MDA 比模型組顯著減少，以上數據表明該方可減輕COPD 小鼠的氧化應激程度。本研究進一步探討了健脾補腎益肺方減輕COPD 小鼠氧化應激水平的機理。Keap1-Nrf2-ARE是近年來抗氧化通路中的研究熱點。在非應激條件下，Nrf2 的天然抑制劑Keap1 將Nrf2 隔離在細胞質中，并促進26S 蛋白酶體對Nrf2 的降解；在應激條件下［12，14-16］，Nrf2 與keap1 分離，轉位到細胞核內，激活ARE 依賴的一系列抗氧化蛋白基因的表達，包括HO-1、NQO1、SOD 等，即HO-1、NQO1、SOD 是Keap1-Nrf2- ARE 信號通路的下游產物。老年吸煙者和COPD 患者巨噬細胞Nrf2 表達降低［17］。Nrf2 系統的激活被認為是一種強大的細胞保護策略［18］。本研究表明，健脾補腎益肺方高、低劑量組SOD 均比模型組顯著增多，健脾補腎益肺方高劑量組HO-1、NQO1 比模型組顯著增多，說明該方具有增強COPD 小鼠抗氧化的作用。健脾補腎益肺方高劑量組Nrf2比模型組顯著增多，說明該方可能通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，上調Nrf2 的表達從而上調SOD、HO-1、NQO1 在肺組織中的表達。另外也有一些研究顯示出了中藥復方或單體對COPD 氧化失衡的作用。如補肺益腎方可提高COPD 大鼠Nrf2、HO-1 等的表達，降低血清過氧化物表達。紅景天苷對COPD 小鼠肺損傷具有保護作用，對COPD 體外細胞模型也具有一定的保護作用，與其抗氧化應激作用密切相關［19-21］。

健脾補腎益肺方高劑量組比低劑量組Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 顯著增多，該方在調節Nrf2 與SOD、HO-1、NQO1 方面呈現出了量效關系。這與氧化應激水平的生物標記物ROS、MDA 在兩組間的變化趨勢相反，高劑量組比低劑量組ROS、MDA 顯著減少；與肺功能在兩組間的變化趨勢一致，高劑量組比低劑量組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%顯著增高。中藥高劑量組比西藥組Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 均顯著增多，另外在降低COPD 小鼠ROS、MDA和提高肺功能方面，中藥復方比西藥組也顯示出了優勢。

綜上所述，COPD 小鼠存在氧化和抗氧化失衡，健脾補腎益肺方可能通過激活COPD 小鼠Keap1-Nrf2-ARE 通路，上調Nrf2 的表達而增加該通路下游抗氧化劑的產生，從而減輕氧化應激程度，保護小鼠肺功能。