兔VX2 移植瘤內間質液壓的分布異質性

陳麗萍 柳建華 黎昱材 陳俏利 何楊成 馮玉儀 翁沛華 胡志文

廣州市第一人民醫院超聲醫學科（廣東廣州 510180）

目前惡性腫瘤被認為是嚴重危及人類健康的主要疾病之一，如何做好腫瘤的預防和治療顯得特別重要。已有文獻表明，腫瘤內的間質液壓（interstitial fluid pressure，IFP）升高會嚴重影響多種傳統治療方法的效果［1］。IFP可導致各種有效藥物在腫瘤內分布的差異性，干擾腫瘤內缺氧的發生、發展，進而降低各種化學治療（化療）藥物和放射治療（放療）的療效［1-3］。然而大多數實體腫瘤內部的IFP因腫瘤內微環境的復雜多變可能會呈現出不均質，存在著異質性。本研究通過建立新西蘭大白兔的皮下淺肌層VX2移植瘤模型，通過針芯法（wick-in-needle method，WIN法）測量VX2移植瘤內部不同區域的IFP，探索腫瘤內部不同區域的IFP分布異質性，為今后腫瘤的治療新途徑提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由廣東省實驗動物中心提供的健康新西蘭兔（體質量2.0～2.5 kg）41只。實驗全過程均嚴格按照NIH（National Institute of Health）實驗動物護理和使用指南進行操作，經過廣州醫科大學實驗動物倫理委員會許可。

1.2 主要實驗相關儀器與材料

1.2.1 微泡：脂氟顯脂質包膜微泡懸浮液，超聲造影成像：0.01 mL/kg。

1.2.2 彩色多普勒超聲診斷儀：GE E9，高頻線陣探頭ML6-15，具備超聲造影模式及時間-信號強度曲線（Time Intenamic Curve，TIC）定量分析軟件。調節檢查診斷深度、增益、聚焦深度、時間增益補償（Time Gain Compensation，TGC）等設置，造影模式機械指數（Mechanical Index，MI）為0.11。

1.2.3 生物信號采集與分析系統：成都泰盟軟件有限公司研制，型號BL-420S。壓力傳感器型號：FT-100S。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備 健康新西蘭大白兔，稱重后以復合麻醉（速眠新Ⅱ聯合戊巴比妥鈉）方法麻醉。待動物角膜反射基本消失、處于麻醉狀態后，側臥位固定于實驗臺上，左后肢備皮。取VX2腫瘤組織塊用眼科剪剪碎至粒徑約1 mm，置于含生理鹽水的一次性培養皿中形成懸液，使用注射器抽吸1～2粒腫瘤組織塊，快速注入兔子左后肢淺肌層［距體表（2.5±0.5）mm］。所有操作過程遵循無菌操作原則，待腫瘤長至長（13±0.2） mm、寬（6±0.2）mm，超聲檢查未見腫瘤內鈣化形成及超聲造影見造影劑充盈良好，無充盈缺損者方可納入實驗［4］。

1.3.2 超聲造影CEUS及結果分析 所有荷瘤兔的腫瘤需通過二維超聲及彩色多普勒模式掃查獲取基本信息（如腫瘤大小、有無壞死鈣化、血供等），且對腫瘤進行分區（以腫瘤半徑的1/2作為腫瘤中心區域，半徑的1/2～1/4處為外周1/2區域，半徑1/4外側為外周1/4區域），符合條件者進行超聲造影（Contrast-Enhanced Ultrasonography，CEUS）及分析。GE E9彩色多普勒超聲診斷系統設置超聲造影（Contrast）模式，機械指數為0.11，調節好適宜的檢查深度、增益、聚焦深度、TGC等設置。經兔耳緣靜脈以團注方式注入微泡，2 mL生理鹽水沖管的同時開始對腫瘤進行超聲造影，獲取并錄制動態影像1 min。

1.3.3 腫瘤內不同區域的IFP測量 WIN法也稱針芯法，是IFP的常用測量方法之一，能測量來自組織深部如腫瘤組織中的壓力。

本實驗測量時，在超聲引導下穿刺針從腫瘤中心區域緩慢退至腫瘤外周區域繼而退至腫瘤周圍正常組織，對腫瘤的中心區域、外周1/2區域、外周1/4區域的IFP進行連續測量并記錄。穿刺針在超聲引導下測量VX2移植瘤IFP值見圖1。腫瘤IFP值由BL-420S生物機能實驗系統采集并分析。

圖1 超聲引導下IFP 值測量（中央）

1.3.4 HE染色 予實驗兔安樂死后取腫瘤組織浸泡于甲醛固定液中，隨后行HE染色，光鏡下觀察腫瘤的病理學改變。

1.4 統計學分析

采用SPSS 24統計軟件進行數據統計并分析。VX2移植瘤內不同區域的IFP值經檢驗呈正態分布，采用均數±標準差（±s）的形式表示，3組間比較采用方差分析，若組間差異有統計學意義，進一步采用LSD-t法進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 超聲的視覺觀察評價

超聲顯示腫瘤內未見鈣化形成，其內及周邊見點條狀血流信號，超聲造影顯示腫瘤內可見微泡快速進入，并完全均勻充填于內，未見充盈缺損現象（圖2），符合上述條件的41個腫瘤可納入本實驗。

圖2 VX2 移植瘤二維超聲圖及超聲造影圖

2.2 腫瘤內IFP的變化

在超聲引導下進行測壓操作，當測量裝置的穿刺針置于腫瘤中心位置并穩定時，腫瘤IFP測值時的波形曲線均表現為正向的波形曲線，當穿刺針在超聲引導下逐漸緩慢水平外移至腫瘤邊緣時（在外周1/2、1/4稍停留以測壓），波形曲線呈平直曲線（中央區域、停留在外周1/2、1/4時）后下降并接近基線；當穿刺針位于腫瘤周緣組織時，曲線呈負向的平直波形曲線（圖3）。

圖3 VX2 移植瘤內IFP 曲線圖

2.3 HE染色

腫瘤內不同區域組織的HE染色病理結果見圖4，可見腫瘤組織呈巢狀分布，血管和纖維組織等交錯分布在癌巢之間，癌巢內可見大小不等的腫瘤細胞分布紊亂，核大而深染，核異型性明顯，有些甚至可見處于不同增殖期的腫瘤細胞，癌巢間及腫瘤內可見血管穿行，形態可辨，呈分支狀或囊狀，其內可見紅細胞分布于管腔內，圖4A、B、C可見圖上顯示的血管數量依次增加，血管周邊均未見明顯紅細胞溢出及未見血栓形成，即腫瘤組織經穿刺測量后，未見血管損傷改變。

圖4 VX2 移植瘤的HE 染色（20X）

2.4 定量分析

4 1 只V X 2 移植瘤的中央I F P為（2 3.7 9±8.07） mmHg，當穿刺針逐漸外移至1/2區時IFP為（15.58±5.22）mmHg，穿刺針繼續外移至1/4區時IFP為（8.29±3.47）mmHg，3組間IFP比較差異有統計學意義（F=70.85，P＜0.05）。進一步進行兩兩比較，中央的IFP值高于外周1/2、外周1/4，外周1/2 IFP值高于外周1/4，即從中央到外周，IFP呈梯度顯著降低（P＜0.05），比較差異均有統計學意義。見表1、圖5。

表1 腫瘤內不同區域IFP值兩兩比較

圖5 腫瘤內從中央到外周IFP 值呈梯度降低

3 討 論

近年來，人們已經認識到腫瘤在生長過程中會出現升高的IFP［5-6］。不少研究證實，高IFP是惡性實體腫瘤的特征［7］。大多數實驗性和人類腫瘤的IFP值為5～40 mmHg，而大多數正常組織的IFP值在-3～3 mmHg之間［8］。對實驗性腫瘤的研究表明，高IFP與化療藥物攝取不良和不均勻［9-10］、放療抵抗機制［11-12］以及侵襲性生長和淋巴結轉移［13-15］有關。臨床研究表明，較高的IFP水平與放療或放化療后局部晚期子宮頸癌的無病生存率和總生存率低相關［16-20］。

有數學模型表明，IFP除了正常組織的表面會突然下降外，在腫瘤中均升高［21］。但這個結論主要是通過算法模擬計算驗證出來的，可能只適合用于一些柔軟且具有低細胞密度、高流體含量和極稀疏細胞外基質組分的均勻組織學的腫瘤，并不適用于大多數其內微環境復雜的實體腫瘤。本實驗將VX2移植瘤接種于新西蘭大白兔的左后肢淺肌層內，采用WIN法測量腫瘤內不同區域的IFP，以探索腫瘤內的IFP在不同區域是否存在異質性，為今后臨床治療腫瘤的新途徑提供參考依據。

本研究是把VX2移植瘤種于新西蘭大白兔的左后肢淺肌層內，因為IFP探針的準確定位需要較表淺的腫瘤。肌內移植優于皮下移植，因為皮下腫瘤與肌內種植相比，在生長早期就會出現中央壞死及鈣化［22-23］。肌內腫瘤IFP通常高于皮下腫瘤，可能是因為肌肉組織對腫瘤組織間質液流入周圍環境的抵抗力高于皮下組織［24-25］。本研究中測量的腫瘤中心IFP為5.00～40.28 mmHg。這些值與大多數實驗性和人類腫瘤的IFP值中測量的范圍一致。

Gutmann等［25］在頭頸部鱗狀細胞癌中使用WIN法檢測IFP，得出在19例病灶中 IFP升高（4～33 mmHg）。此外，IFP隨腫瘤大小而增加，說明腫瘤的大小會影響腫瘤內IFP的測值。本研究中納入實驗的腫瘤長徑為（13±0.2）mm、寬徑為（6±0.2）mm差異，所以在本實驗中腫瘤的體積大小不是影響腫瘤內IFP的決定因素。

本研究對41只荷瘤兔在超聲引導下進行腫瘤測壓，腫瘤中央IFP為（23.79±8.07）mmHg、腫瘤外周1/2的IFP為（15.58±5.22）mmHg、腫瘤外周1/4的IFP為（8.29±5.47）mmHg（±s）。IFP 隨著不同區域變化（F=70.85，P＜0.05），中央的IFP高于外周1/2、外周1/4，外周1/2高于外周1/4。腫瘤內IFP在不同區域存在異質性，結合從中央-外周的壓力曲線，可得出腫瘤從中央到外周，IFP降低。這有可能是引起在治療腫瘤時各種化療藥物在其內難滲透且分布不均勻的原因之一。在研究高IFP對腫瘤對治療的反應和臨床結果的影響的研究中，對腫瘤內IFP異質性的了解是必不可少的。

實體瘤內的壓力可分為兩個組成部分：流體壓力（凝膠相）和固體壓力（固相）［26］。流體壓力可分為毛細管的壓力和間質的壓力，進一步都可以細分為靜水壓力和膠體滲透壓。在正常情況下，由于血管內皮的低滲透性，血漿蛋白仍然保持在血管內，因此相對于間質的膠體滲透壓，保持較高的毛細管膠體滲透壓。外滲的液體和蛋白質通過毛細血管后靜脈和淋巴管重新吸收進入體循環，從而調節組織壓力。

由本研究的HE染色病理結果看，在進行測量結束后，腫瘤組織內的血管周邊未見紅細胞溢出及血栓形成，即說明WIN法測量對腫瘤組織內造成明顯損傷，尤其是未引起血管損傷；從圖4可見從中央至外周的血管數量似在增加，此可能跟腫瘤組織的IFP分布異質性相關。

所以，我們推測造成腫瘤內不同區域IFP的異質性，從中央到外周，呈梯度顯著下降的可能原因有可能是包括腫瘤內中央缺氧區的分布、腫瘤內畸形血管的分布特點及膠原纖維等細胞外基質成分的分布特點：

首先，間質體積的增加引起淋巴流量的增加，以防止間質液的進一步積聚［27］。與正常組織不同，腫瘤細胞的增殖速度快于其血管形成。只有當腫瘤的生長不超過距離滋養血管＞1～2 mm的距離，腫瘤才能保持充足的氧合和營養［28］。因此隨著腫瘤的生長，現有的血管變得不足以提供足夠的氧氣和營養供應以適應增加的細胞代謝需求。腫瘤間質中代謝廢物的積累也增加，這情況在腫瘤中央區域（缺氧區）的表現更為顯著。這兩個因素產生了異常的腫瘤微環境，其引發間質中基質細胞的生成增加，包括癌癥相關的成纖維細胞和免疫細胞，如巨噬細胞。巨噬細胞和腫瘤細胞可以上調各種細胞因子的產生，包括血管內皮生長因子（Vascular-endothelial-growthfactor，VEGF）、血小板源生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）［26］，這些細胞因子可以刺激血管生成產生新的血管，以適應不斷增加的代謝需要。這些細胞因子的過度表達會導致腫瘤血管的異常和扭曲。這些血管內皮細胞層不完整或缺失，基底膜改變，使其具有高滲透性。這使得更多的液體和血漿蛋白滲出到腫瘤間質，從而降低微血管靜水壓并增加IFP。

血管通透性增加與腫瘤體內異常或缺失的淋巴管相結合，導致間質中液體和蛋白質的進一步積聚［7-8］，從而促進腫瘤內IFP的升高，并且也有可能造成腫瘤內不同區域IFP的異質性。

另外，Hansem Lise Mari K 等［29］的研究也提供了重要的證據，證明腫瘤中的間質液流動可被纖維化基質成分抑制，導致腫瘤內IFP異質性顯著。因此，腫瘤內膠原纖維等細胞外基質成分的分布特點（差異性）也是影響腫瘤內IFP在不同區域存在異質性的重要因素，而這一因素是如何影響腫瘤內IFP的機制有待進一步研究探索。