基于人工智能的細胞形態學分析在白細胞分類中的臨床應用

邱 實, 宋鵬飛, 常志紅, 夏迎龍, 張立新, 李 然,連思博, 王懿馨, 劉 杰, 2

(1. 中國人民解放軍總醫院第七醫學中心 檢驗科, 北京, 100700;2. 南方醫科大學 第二臨床醫學院 廣東 廣州, 510280)

血細胞形態學檢查包括對外周血白細胞(WBC)的計數和形態學的分析,目前仍是臨床上血液系統疾病和非血液系統疾病基礎診斷與常規血液學檢驗的重要項目,是最基本、最簡便實用的檢查方法[1-3]。目前,血細胞計數已經擺脫了傳統手工操作、顯微鏡下檢查的方式,可以由自動血液分析儀完成[4]。但血細胞分析儀尚不具備識別紅細胞、白細胞、血小板形態的能力,無法完全替代顯微鏡對血細胞的識別和分類檢查[5]。細胞學家、數學家和工程師之間的密切合作,促進了正常血細胞數字圖像處理自動工具的發展[6-7]。目前,市面上主流的全自動血細胞數字化分析儀DM/DI系列,如全自動細胞形態學分析儀采用人工智能(AI)神經網絡系統對WBC進行分類。為了進一步評估全自動細胞形態學分析儀對外周血WBC預分類的能力,并探討全自動血細胞形態學數字圖像分析在WBC形態學檢查中的臨床應用價值,本研究以手工計數結果為標準參考,比較了目前國內醫院檢驗科常用的全自動血液分析儀,對全自動細胞形態學分析儀計數法的臨床計數結果進行比較研究,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機收集2023年1—5月中國人民解放軍總醫院第七醫學中心住院和門診患者的乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血標本306份,其中感染性疾病患者15例,實體腫瘤患者18例,血液病患者20例,其他疾病患者54例,健康體檢者199例; 男162例(52.9%), 平均年齡(39.4±20.8)歲; 女144例(47.1%), 平均年齡(35.5±18.6)歲。本研究獲得中國人民解放軍總醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 主要儀器與試劑

全自動血液分析儀xn-20(日本希森美康公司),全自動血液分析儀xn-10(日本希森美康公司),全自動細胞形態學分析儀SP-10(日本希森美康公司),全自動細胞形態學分析儀DI-60(日本希森美康公司), CX23光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司),瑞氏-吉姆薩染色液(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3 全自動細胞形態學分析儀計數

血液采集后4 h內,采用全自動細胞形態學分析儀SP-10自動推片染色儀制備外周血涂片,并應用全自動血細胞分析儀對200個WBC進行自動分析,采用人工智能神經網絡系統將WBC分為19類,包括中性桿狀核粒細胞、中性分葉核粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性早幼粒細胞、中性中幼粒細胞、中性晚幼粒細胞、幼稚嗜酸粒細胞、幼稚嗜堿粒細胞、幼稚單核細胞、幼稚淋巴細胞、原始細胞、異型淋巴細胞、漿細胞、大顆粒淋巴細胞、毛細胞、賽塞利細胞。白細胞分析工作步驟為: 根據巴特曼形式對白細胞層進行掃描,即從血涂片細胞層較厚一側固定位置開始搜索單細胞層并定位; 自動轉換到100倍物鏡,系統開始抓取細胞圖像; 獲得專利的自動對焦技術(使用人工智能預測方向和距離呈現出一張最佳對焦的圖像,該過程只需1～3張圖像)進行自動對焦; 當細胞被對焦后,即對細胞特性進行切分(放大100倍),對360種以上的特性進行分析; 進行細胞預分類(人工智能神經網絡系統),向細胞層較薄一側逐一掃描,在10倍鏡下抓取圖像,直到確定單細胞層起止點; 最后保存細胞圖像及數字掃描區域圖像。

1.4 全自動血液分析儀計數

對所有樣本采用全自動血液分析儀xn-20/xn-10進行WBC計數分析。嚴格按照儀器標準操作規程進行日常操作,開機維護后,檢測其質控結果,若有失控情況及時處理,各項質控均在控后,作為常規標本將實驗標本進行檢測,并記錄其WBC結果。需要說明的是,全自動血細胞分析儀僅能識別WBC 5個種類: 粒細胞(一般默認是中性分葉核細胞)、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞。

1.5 手工計數法

由3位形態學專家根據《WS/T246-2005白細胞分類參考方法》[8]對所有標本進行WBC手工計數,即先由第1位專家和第2位專家對每個標本的2張血涂片分別鏡檢,并對200個白細胞進行分類,當2位專家結果超出95%置信區間時,再由第3位更資深的專家選取第3張血涂片進行確認,輸出最終的人工鏡檢結果。評估專家審核后的WBC分類結果與人工顯微鏡鏡檢結果的相關性。上述19類WBC種類手工計數法均可識別。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 全自動細胞形態學分析儀、全自動血液分析儀和手工計數法對白細胞預分類結果的比較

采用全自動細胞形態學分析儀、全自動血液分析儀和手工計數法共3種方法對白細胞進行預分類,全自動細胞形態學分析儀識別的白細胞種類最多,原則上可識別白細胞種類共19類; 本研究統計的血液樣本識別結果顯示,全自動細胞形態學分析儀共識別出12類白細胞種類,除了識別出的6類成熟WBC(中性桿狀核粒細胞、中性分葉核粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)外,也可識別各階段幼稚粒細胞和異常細胞共6類; 其中原始細胞、漿細胞只有全自動細胞形態學分析儀檢出。手工計數法共識別出白細胞種類11類。全自動血細胞分析儀識別出的白細胞種類最少,共7類。3種方法均能識別出的白細胞種類共7類,包括5類成熟WBC、異型淋巴細胞和中性早幼粒細胞。見圖1。

圖1 3種方法對白細胞預分類的結果比較

全自動細胞形態學分析儀與手工計數法比較的配對卡方檢驗結果顯示χ2=0,P>0.999, 提示2種方法對WBC預分類種類比較不存在差異; 一致性檢驗顯示Kappa=0.67,P=0.000 1, 提示2種方法診斷結果具有中等一致性。全自動細胞形態學分析儀與全自動血細胞分析儀比較的配對卡方檢驗結果提示2種方法存在差異(χ2=5.14,P=0.02), 2種方法診斷結果存在較差一致性(Kappa=0.34,P=0.02)。上述結果表明全自動細胞形態學分析儀識別白細胞種類的能力較好。

2.2 全自動細胞形態學分析儀、全自動血液分析儀和手工計數法計數結果比較

對3種方法計數WBC結果進行比較分析, 3組配對樣本Wilcoxon檢驗結果顯示,除了中性早幼粒細胞外,其他白細胞分類在3種方法間存在差異,其中全自動細胞形態學分析儀與全自動血液分析儀對中性早幼粒細胞計數的差異無統計學意義(P>0.05)。采用全自動細胞形態學分析儀和手工計數法對6類成熟WBC種類、3類幼稚粒細胞及異型淋巴細胞計數的結果均相近,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。由此可見, 3種方法比較結果差異的主要來源是全自動細胞形態學分析儀與全自動血液分析儀,全自動細胞形態學分析儀和手工計數法對絕大多數白細胞種類計數具有可比性,結果可靠。

表1 全自動細胞形態學分析儀、全自動血液分析儀和手工計數法的WBC計數結果

A: 中性桿狀核粒細胞計數情況; B: 中性分葉核粒細胞計數情況; C: 淋巴細胞計數情況; D: 單核細胞計數情況;E: 嗜酸性粒細胞計數情況; F: 嗜堿性粒細胞計數情況。與血液分析儀比較, ****P<0.000 1。

2.3 全自動細胞形態學分析儀與手工計數法的相關性分析

對WBC樣本進行Passing-Bablok回歸分析,計算全自動細胞形態學分析儀與手工計數法結果的相關性,結果顯示, 6類成熟WBC(中性分葉核粒細胞、中性桿狀核粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)的全自動細胞形態學分析儀與手工計數法計數結果相關性良好(相關系數r>0.8, 截距均接近0, 斜率均接近1), 表明全自動細胞形態學分析儀與手工計數法結果具有較好的一致性。這6類細胞的斜率均接近或等于1, 一致性較好。在中性分葉核粒細胞的Passing-Bablok回歸方程中,截距為0, 表明2種方法間沒有恒定系統誤差。其余異常WBC因樣本量較小或數據計算過程中存在過多待定回歸系數的重抽樣樣本,無法進行回歸分析。見圖3、表2。

表2 全自動細胞形態學分析儀與手工計數法的相關性分析

A: 2種方法在中性桿狀核粒細胞中的相關性; B: 2種方法在中性分葉核粒細胞中的相關性; C: 2種方法在淋巴細胞中的相關性;D: 2種方法在單核細胞中的相關性; E: 2種方法在嗜酸性粒細胞中的相關性; F: 2種方法在嗜堿性粒細胞中的相關性。

3 討 論

盡管外周血形態學具有重要的診斷作用,但沒有用于定義細胞學變量的客觀值。血細胞獨特的細胞學特征是主觀的,并受審閱者解釋的影響[9]。目前基于外周血涂片自動形態學計算機成像的新型血液分析儀在國內外快速發展,隨著生物信息學和生物醫學應用的需求不斷增加,血細胞形態分析受到了廣泛關注[10-11]?；贏I技術的數字顯微鏡和計算機圖像分析可以提供更準確和客觀的形態學評估,將細胞學定性參數轉化為定量值?；趫D像分析的定量形態學特征可提取大量描述相關細胞形態特征的測量值和參數; 通過自動或計算機化圖像分析從數字圖像中提取有意義的信息,從而達到對不同類別的細胞進行預分類的目的[9]。本研究評估的全自動細胞形態學分析儀根據AI神經網絡系統可將WBC分為19類,包括成熟WBC和異常細胞。由于目前該設備臨床評估較少,因此本研究對該儀器的WBC預分類功能進行評估和比較。

本研究結果表明,采用3種不同的方法(全自動細胞形態學分析儀、全自動血液分析儀和手工計數法)檢測相同的血液樣本,全自動細胞形態學分析儀可識別出最多的WBC種類共12類,包括了6類成熟WBC和6類異常細胞,其中原始細胞和漿細胞是全自動細胞形態學分析儀所特有識別的。全自動細胞形態學分析儀采用了深度學習的神經網絡算法,機器學習分類器使用360種以上的特征進行訓練,用于自動識別異常細胞圖像,可大大提高不同類型細胞識別的符合率和檢出率[12-13]。

細胞識別譜是指自動化血細胞分析儀能識別分類或判定細胞形態學特征并可給出細胞預分類、細胞形態學變化預表征結果的各種細胞類型或形態學特征的集合[12]。細胞識別譜的范圍越寬,細胞種類越完整,形態學特征判定越精準,血細胞形態學分析儀的臨床適用范圍越廣,尤其是對異常細胞的識別,可減少臨床疾病尤其是惡性血液病的漏檢率,及時為臨床提供有價值的細胞診斷信息[14-16]。由于異常細胞形態多變,有些異常細胞的特性還不典型,手工計數法極大地依賴于識別者的知識結構和經驗,基于不同專家之間存在識別差異,常常會出現漏檢甚至是誤檢。AI輔助血細胞形態學檢查的規范化、標準化,可保證AI血細胞形態學檢查結果的準確性和一致性。

3種方法對WBC種類計數結果顯示,全自動細胞形態學分析儀對6類成熟WBC、各階段幼稚細胞和異常細胞(異型淋巴細胞)計數與手工計數結果無顯著差異,具有良好的一致性; 全自動細胞形態學分析儀和全自動血液分析儀對WBC計數的差異較大,顯示了2種機器不同的WBC分類性能。相關性結果顯示,全自動細胞形態學分析儀和手工計數法計數6類成熟WBC有良好的相關性。除中性分葉核粒細胞相關系數r>0.8外,其余成熟WBC的2種方法計數結果相關系數r>0.9, 這可能是由于該儀器拍攝的中性分葉核粒細胞圖像與顯微鏡下直接觀察到的細胞形態有一定的差別。參考細胞庫的容量會影響細胞預分析結果的符合率。在使用擴充的參考細胞庫預分析時,具有重要臨床意義細胞的分析符合率較使用初始參考細胞庫時有明顯提高[17]。由此提示,在實際工作中需要不斷完善參考細胞庫以提高預分析結果的符合率。由于異常細胞陽性標本較少,異常細胞的相關性分析無法進行。后續研究將繼續收集異常細胞的樣本,進一步分析其全自動細胞形態學分析儀計數與人工計數結果的相關性。

綜上所述,全自動細胞形態學分析儀可分類更多的WBC種類,可提供與手工顯微鏡檢高度一致的WBC計數結果,且兩者計數具有良好的相關性。AI在血細胞形態分析上的應用可大大提高WBC形態分析的效率,在保證檢查結果準確性的同時減少人力投入,提高血細胞分析質量,降低相應疾病的漏檢率。