蟾毒靈聯合索拉非尼通過RhoA/ROCK/HIF1α通路抑制肝癌HepG2細胞增殖、遷移及侵襲的機制

王一同,尹 玲,勾春燕,張麗麗,汪曉軍

(1. 首都醫科大學附屬北京佑安醫院,北京 100069;2. 中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053)

原發性肝癌起病隱匿,復發轉移率和病死率高。2020年GLOBOCAN數據顯示,原發性肝癌發病率居所有惡性腫瘤的第6位,是第3大癌癥死亡原因[1]。索拉非尼為一種小分子多激酶抑制劑,是第一個批準用于治療晚期肝細胞癌的靶向藥物,其作用靶點為血管內皮細胞生長因子受體、血小板衍生生長因子受體等,通過直接抑制腫瘤生長和腫瘤血管新生達到抗腫瘤的作用。盡管索拉非尼可使晚期肝癌患者生存獲益,但在臨床實踐中,耐藥及病情進展仍不可避免[2]。因此,尋求靶向藥物的聯合治療方案,延緩病情進展是臨床工作的重中之重。蟾毒靈是中藥蟾酥的提取物,具有清熱解毒、化瘀潰堅、利水消腫等作用,對肝癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤具有顯著抗癌作用[3]。目前研究發現, Ras同源基因蛋白A(RhoA)/含Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/缺氧誘導因子1α (HIF1α)信號通路是腫瘤缺氧微環境激活的關鍵通路,該通路的激活可促進肝癌的侵襲、轉移[4-7]。而華蟾素注射液可通過抑制 HIF1α 的表達逆轉腫瘤缺氧微環境[8],蟾毒靈作為華蟾素注射液中的主要抗腫瘤活性成分,結構明確,更利于研究開發。故本研究基于Rho/ROCK/HIF1α信號通路探討了蟾毒靈與索拉非尼對肝癌HepG2細胞增殖、遷移及侵襲的協同抑制作用及機制,以期優化中晚期肝癌聯合治療方案,提高臨床療效。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株 人肝癌HepG2細胞株,購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源庫。

1.2藥品與主要試劑 蟾毒靈,AbMole公司,貨號:M11138;索拉非尼,AbMole公司,貨號:BAY 43-9006。H-DMEM 基礎培養基、青鏈霉素雙抗,美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液(0.25%),美國Gibco公司;CCK-8試劑盒,日本同仁化工有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL超敏發光試劑盒,北京普利萊基因技術有限公司;兔抗一抗RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α,Proteintech公司。

1.3常規細胞培養方法 肝癌HepG2細胞接種于H-DMEM完全培養基(含10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素),37 ℃、5% CO2體積分數細胞培養箱中培養。細胞貼壁生長,每2d傳代1次。

1.4CCK-8細胞增殖實驗 取對數生長期的HepG2細胞,消化、重懸,以1×104/孔濃度將細胞接種于96孔板中;設置調零組、空白對照組、不同濃度給藥組(蟾毒靈1,2,4,8,16 μg/mL;索拉非尼1,5,10,20,40 μmol/L),板四周的孔不種細胞,加入PBS減少培養液揮發;96孔板在細胞培養箱中過夜,待細胞貼壁,分別向各組細胞加入相應培養基200 μL,培養24 h,棄掉各組培養液上清,重新加入100 μL含有10% CCK-8溶液的完全培養基,培養箱避光培養2 h后,酶標儀測定450 nm的吸光度(OD值),繪制增殖曲線。

1.5Transwell細胞遷移、侵襲實驗

1.5.1細胞遷移實驗 將肝癌HepG2細胞分為空白對照組(不進行任何處理)、蟾毒靈組、索拉非尼組、蟾毒靈聯合索拉非尼組,按實驗分組每瓶細胞加入5 mL含蟾毒靈、索拉非尼、蟾毒靈聯合索拉非尼的DMEM基礎培養基,培養24 h。棄去無血清培養基,消化、離心,重懸細胞;取上述細胞懸液200 μL(約含5×104細胞)逐滴加入小室,另取200 μL富含血清的培養基沿孔壁的空隙處加入到孔中,勿誤加入小室內。將接種好的細胞常規培養24 h。將小室取出,棄去孔中培養基,上室中加入200 μL 4%多聚甲醛細胞固定液,將小室置于已加入500 μL 0.1%結晶紫染色液的培養孔中,染色20 min。將小室移入新的培養孔,PBS洗3次,濕棉簽擦去小室內部未穿過上室膜的細胞。倒置顯微鏡觀察穿過上室膜的細胞數,光鏡下計數3個視野的細胞數,取平均值。

1.5.2細胞侵襲實驗 將Matrigel基質膠與DMEM基礎培養基按1∶8比例混勻,吸取50 μL,平鋪于Transwell小室底部聚碳酸酯膜上,小室放入37 ℃培養箱2 h待基質膠凝固。余步驟同細胞遷移實驗。

1.6RhoA/ROCK /HIF1α通路相關蛋白表達Western blot檢測 將肝癌HepG2細胞分為空白對照組(不進行任何處理)、蟾毒靈組、索拉非尼組、蟾毒靈聯合索拉非尼組,按實驗分組每瓶細胞加入5 mL含蟾毒靈、索拉非尼、蟾毒靈聯合索拉非尼的DMEM基礎培養基,培養24 h后,收集各組細胞,加入RIPA細胞裂解液(內含蛋白酶抑制劑)冰上裂解;BCA蛋白濃度測定;取總蛋白量相等的樣品進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;PVD膜電轉;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;稀釋一抗( HIF1α 1∶81 000,RhoA 1∶81 000,ROCK1 1∶85 000,ROCK2 1∶82 000),孵育一抗4 ℃過夜;TBST緩沖液室溫清洗3次;加入二抗(稀釋比例1∶810 000)室溫孵育1 h,TBST室溫清洗3次;ECL試劑盒顯色;Image J軟件進行分析。

1.7統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料采用Shapiro-Wilks(W)方法進行正態分布檢驗,符合正態分布的數據多組間樣本均數比較采用單因素方差分析,兩兩多重比較采用LSD-t方法;不符合正態分布的數據組間差異采用對應的非參數檢驗;檢驗水準α=0.05(雙尾)。

2 結 果

2.1肝癌HepG2細胞增殖情況 蟾毒靈及索拉非尼單藥均可抑制肝癌HepG2細胞的增殖。蟾毒靈作用24 h的IC50為3.866 μg/mL,索拉非尼作用24 h的IC50為20.173 μmol/L。為避免藥物濃度過高對細胞活力的影響,后續實驗干預濃度蟾毒靈為4 μg/mL、索拉非尼為20 μmol/L。見圖1。

圖1 蟾毒靈及索拉非尼對肝癌HepG2細胞增殖的影響

2.2肝癌HepG2細胞遷移、侵襲情況 培養24 h后,蟾毒靈組、索拉非尼組及蟾毒靈聯合索拉非尼組肝癌HepG2細胞的遷移與侵襲率均明顯低于空白對照組(P均<0.05),且蟾毒靈聯合索拉非尼組肝癌HepG2細胞的遷移與侵襲率均明顯低于蟾毒靈組和索拉非尼組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 空白對照組和各藥物干預組肝癌HepG2細胞遷移、侵襲情況

2.3RhoA/ROCK /HIF1α通路相關蛋白表達情況培養24 h后,索拉非尼組和蟾毒靈聯合索拉非尼組肝癌HepG2細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α蛋白相對表達量均明顯低于空白對照組(P均<0.05),且蟾毒靈聯合索拉非尼組各蛋白相對表達量均明顯低于蟾毒靈組和索拉非尼組(P均<0.05);蟾毒靈組各蛋白相對表達量與空白對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖3。

3 討 論

蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的主要活性單體之一。《本草綱目》記載:“蟾酥治發背疔瘡,一切惡腫。”《本草匯言》記載:“蟾酥療疳積,消臌脹,解疔毒之藥也,能化解一切瘀郁壅滯諸疾,如積毒、積塊、積膿、內疔癰腫之證,有攻毒拔毒之功也。”可見在古時人們就意識到蟾酥抗惡性瘡瘍、癌腫的作用。基礎研究發現,蟾毒靈可抑制雞胚尿囊膜模型的血管生成,抑制內皮細胞參與的芽生性血管新生[9]。Wang等[10]研究發現,蟾毒靈能夠通過調控Akt/VEGF信號增強索拉非尼的抗內皮細胞參與的血管生成。可見,抗血管生成是蟾毒靈與索拉非尼發揮協同抗腫瘤作用的重要機制。

腫瘤缺氧微環境是促進腫瘤血管新生的重要激發因素,HIF1α在腫瘤細胞對缺氧微環境的適應性反應中起到重要作用。既往研究發現,缺氧環境培養顯著增強了HepG2細胞的成管能力,同時增加了Notch1和血管內皮鈣黏蛋白的表達,還可誘導 Bcl-2和Twist1共表達,在體外和體內均能增強肝癌細胞的上皮間質轉化(EMT)過程和促進血管新生[11-12]。任光明[13]研究發現,華蟾素聯合放化療治療晚期肺癌患者,可顯著降低血清HIF1α水平,抑制腫瘤血管新生。本研究發現,蟾毒靈聯合索拉非尼對HIF1α的表達亦有明顯抑制作用,逆轉腫瘤缺氧微環境可能是蟾毒靈聯合索拉非尼協同抑制肝癌細胞侵襲、轉移的機制之一。

ROCK1、ROCK2是RhoA的下游靶點,ROCK是腫瘤細胞血管生成擬態形成的關鍵因子[14]。楊錦秀[15]研究發現,RhoA/ROCK信號通路能通過干預AngⅡ的表達發揮對體外血管形成的抑制作用;奚嬌嬌[16]報道,黃酮類化合物能通過抑制RhoA/ROCK信號通路改善腦缺氧缺血損傷;梅曉峰[17]研究發現,麝香烏龍丸能通過干預RhoA/ROCK信號通路,減輕機體微血管屏障的損傷。ROCK2作為HIF1α的上游,參與HIF1α在缺氧條件下的調控,RhoA/ROCK2信號通路通過HIF1α穩定和EMT激活p-Vimentin (Ser72和56)參與缺氧誘導的肝癌血管新生[4],抑制RhoA/ROCK信號通路,能夠抑制肝癌細胞的生長、轉移及血管生成擬態的形成[18-19]。本實驗結果顯示,蟾毒靈單獨用藥時并未表現出對RhoA/ROCK/HIF1α通路相關靶點的抑制作用,聯合索拉非尼后則表現出顯著的抑制作用,且比索拉非尼單藥用藥抑制作用增強。提示蟾毒靈聯合索拉非尼抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制可能為通過下調RhoA、ROCK1、ROCK2表達,抑制HIF1α的激活,從而逆轉腫瘤缺氧微環境對肝癌細胞的影響,最終抑制肝癌的復發轉移。

綜上所述,蟾毒靈聯合索拉非尼抗肝癌HepG2細胞增殖、遷移及侵襲的作用與調控RhoA/ROCK/HIF1α信號通路有關,為中晚期肝癌聯合診療提供了基礎研究依據,然而尚需開展體內實驗研究,對蟾毒靈聯合索拉非尼抑制肝癌復發轉移的機制進行進一步驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。