葛根素調控miR-30b-5p表達抑制類固醇誘導的兔股骨頭壞死

馬曼華 王珊 孟東方

1. 商丘醫學高等?？茖W校臨床醫學院康復教研室,河南 商丘 476005 2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院骨科,河南 鄭州 450003

類固醇誘導的股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種慢性進行性股骨頭疾病,主要由長期過量糖皮質激素誘發,可引起髖關節損傷和功能障礙,最終影響患者生活質量[1]。目前治療ONFH常用的藥物有雙膦酸鹽、他汀類藥物和抗凝血劑,這些藥物通過不同的藥理機制可以部分恢復骨細胞的功能,但其卻存在明顯的副作用如胃腸道刺激、腎毒性或下頜關節壞死等[2]。因此,開發一種效果顯著、不良反應少的抗ONFH藥物至關重要。葛根素是葛根中主要的異黃酮成分之一,具有抗骨質疏松、抗氧化等活性[3]。已有研究報道,葛根素通過促進壞死部位新骨生成,對激素性股骨頭壞死模型大鼠發揮治療作用,但具體機制尚不完全明確[4]。相關研究顯示,葛根素通過上調miR-34a促進類固醇誘導的股骨頭壞死兔的成骨作用;抑制miR-30b-5p表達可促進類固醇誘導的股骨頭壞死的軟骨細胞凋亡[5-6]。但葛根素能否通過調控miR-30b-5p表達改善類固醇誘導的ONFH尚不明確。因此,本研究主要探究葛根素對類固醇誘導的ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的影響以及可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:84只3月齡體質量為2.25～2.5 kg的新西蘭大白兔購自廣東雙林生物制藥有限公司,生產許可證號SCXK(粵)2023-0003。

1.1.2主要試劑:葛根素購自上海同田生物技術有限公司;大腸桿菌內毒素購自上海烜雅生物科技有限公司;甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液購自國藥集團容生制藥有限公司;仙靈骨葆膠囊購自貴州同濟堂制藥有限公司;miR-30b-5p拮抗劑(antagomir)及其陰性對照antagomir NC 購自百奧邁科生物技術有限公司;兔超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)ELISA試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司;鼠源一抗Dickkopf-1(DKK-1)、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1ONFH兔模型的構建:ONFH模型的構建[7]:向兔耳緣靜脈注射兩次大腸桿菌內毒素(10 μg/kg),兩次間隔時間為24 h,末次注射內毒素后,立刻通過臀肌注射三次甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液(25 mg/kg),三次間隔時間為24 h。

1.2.2動物分組及處理:按照隨機數字表法將84只新西蘭大白兔分為對照組、ONFH組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組、陽性對照組、葛根素高劑量+antagomir NC組、葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組,每組12只。對照組以生理鹽水代替大腸桿菌內毒素、甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液,其余操作同造模過程;其余各組均需采用大腸桿菌內毒素聯合甲潑尼龍琥珀酸鈉的方式構建ONFH模型。若Micro-CT結果顯示,兔股骨骨小梁數量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,且HE染色顯示兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分斷裂,骨小梁內的骨細胞數量減少,空骨陷窩數增多,則表明模型構建成功,然后進行給藥處理。葛根素低劑量組、葛根素高劑量組[5]、陽性對照組[7]分別予以灌胃0.125 g/kg葛根素、0.5 g/kg葛根素、0.4 g/kg仙靈骨葆膠囊,且均需尾靜脈注射等量的生理鹽水;葛根素高劑量+antagomir NC組灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只antagomir NC;葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組[8]灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只miR-30b-5p antagomir;對照組、ONFH組灌胃等量的生理鹽水且還需尾靜脈注射等體積的生理鹽水。給藥一天一次,持續12周。

1.2.3標本收集:末次處理24 h后,處死大白兔,收集大白兔的股骨頭,分為兩部分,一部分固定于4 %多聚甲醛中用于Micro-CT掃描、HE染色及TUNEL染色,另一部分凍存于-80 ℃冰箱中用于ELISA、qRT-PCR、Western Blot檢測。

1.2.4Micro-CT檢測:利用Micro-CT掃描固定于4 %多聚甲醛溶液中48 h的股骨頭,并分析骨計量學參數骨小梁數量、骨小梁厚度及骨小梁分離度。

1.2.5HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化:取1.2.3中的股骨頭,在10 % EDTA中脫鈣,并包埋在石蠟中。然后將組織切成5 μm厚的切片。用HE對連續切片進行染色,使用光學顯微鏡記錄組織病理學變化,Image-Pro Plus 6.0軟件分析切片上的空骨陷窩數、總骨陷窩數,并計算空骨陷窩率,空骨陷窩率(%)=(空骨陷窩數/骨陷窩數×100 %)。

1.2.6ELISA法檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量:嚴格按照試劑盒說明書檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量。

1.2.7TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中細胞凋亡:取1.2.5中的股骨頭組織切片,根據TUNEL試劑盒說明書步驟檢測細胞凋亡,凋亡細胞呈綠色熒光,正常細胞的細胞核被染成藍色。細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100 %。

1.2.8qRT-PCR檢測股骨頭組織中miR-30b-5p表達:利用TRIzol試劑提取股骨頭組織勻漿總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應。以U6為內參,通過2-ΔΔCt法計算miR-30b-5p相對表達量。引物序列:U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′;miR-30b-5p-F: 5′-CCGAAACATCCT ACACTCAGCTAA-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGG AGT-3′。

1.2.9Western Blot檢測股骨頭組織中DKK-1蛋白表達:利用RIPA裂解緩沖液提取股骨頭組織勻漿總蛋白,將50 μg總蛋白經電泳、轉膜、封閉后,在4 ℃下將膜與一抗DKK-1、GAPDH孵育過夜,再將膜與二抗共同孵育1.5 h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡,利用Image J軟件評估目的蛋白灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 葛根素對各組兔股骨頭區骨小梁數量、骨小梁厚度及骨小梁分離度的影響

與對照組比較,ONFH組骨小梁數量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組骨小梁數量、骨小梁厚度升高,骨小梁分離度降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組骨小梁數量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05),見圖1和表1。

表1 各組兔股骨區骨小梁數量、骨小梁厚度及骨小梁分離度變化比較Table 1 Comparison of changes in the number, thickness, and separation of bone trabeculae in the femoral region of rabbits in each group n=6)

圖1 Micro-CT掃描檢測兔股骨微結構Fig.1 Micro-CT scan to detect the microstructure of rabbit femur

2.2 葛根素對各組兔股骨頭組織病理變化的影響

對照組兔股骨頭組織無明顯異常,骨小梁整齊致密,排列規則,骨小梁內的骨細胞分布清晰均勻,骨陷窩豐富;ONFH組兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分斷裂,骨小梁內的骨細胞數量減少,空骨陷窩數增多;與對照組比較,ONFH組空骨陷窩率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組空骨陷窩率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組空骨陷窩率升高(P<0.05),見圖2和表2。

表2 各組兔空骨陷窩率變化比較Table 2 Comparison of changes in empty bone lacuna rate among different groups of rabbits n=6)

圖2 HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化(200×)Fig.2 HE staining detection of pathological changes in rabbit femoral head tissue (200×)

2.3 葛根素對各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量的影響

與對照組比較,ONFH組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05),見表3。

表3 各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量變化比較Table 3 Comparison of changes in SOD activity and MDA content in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

2.4 葛根素對各組兔股骨頭組織中細胞凋亡的影響

與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中細胞凋亡率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組兔股骨頭組織中細胞凋亡率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組兔股骨頭組織中細胞凋亡率升高(P<0.05),見圖3和表4。

表4 各組兔股骨頭組織中細胞凋亡率變化比較Table 4 Comparison of changes in cell apoptosis rate in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

圖3 TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中骨細胞凋亡(400×)Fig.3 TUNEL staining for detecting osteocyte apoptosis in rabbit femoral head tissue (400×)

2.5 葛根素對各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達及DKK-1蛋白表達的影響

與對照組比較,ONFH組miR-30b-5p表達降低,DKK-1蛋白表達升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組miR-30b-5p表達升高,DKK-1蛋白表達降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組miR-30b-5p表達降低,DKK-1蛋白表達升高(P<0.05),見圖4和表5。

表5 各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達及DKK-1蛋白表達變化比較Table 5 Comparison of changes in miR-30b-5p expression and DKK-1 protein expression in femoral head tissues of rabbits in each group n=6)

圖4 Western Blot檢測兔股骨頭組織中DKK-1蛋白Fig.4 Western Blot detection of DKK-1 protein in rabbit femoral head tissue注:A:對照組;B:ONFH組;C:葛根素低劑量組;D:葛根素高劑量組;E:陽性對照組;F:葛根素高劑量+antagomir NC組;G:葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組。

3 討論

ONFH是一種常見且迅速致殘的疾病,大多數患者會在2～3年內出現股骨頭塌陷,最終出現髖關節功能障礙,給患者家庭和整個社會帶來不可估量的勞動和經濟損失[9]。Micro-CT是可通過全面、立體的方式測量骨微結構、評價骨質量及預測骨強度的新型技術[7]。本研究利用該技術檢測了ONFH兔模型的骨計量學參數,結果顯示,與對照組比較,ONFH組骨小梁數量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,表明ONFH兔模型的骨計量學參數異常。據報道,氧化應激與類固醇誘導的ONFH過程密切相關,在激素誘導的ONFH兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量升高[10]。此外,骨細胞凋亡與ONFH的發生和進展密切相關,當ONFH發生時,股骨頭的內部血液供應被切斷,導致骨細胞營養不足進而誘導細胞凋亡,骨小梁組織也被慢慢拉松,最終引起股骨頭塌陷[11]。本研究顯示,與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量、骨細胞凋亡率及凋亡相關蛋白DKK-1蛋白表達升高,股骨頭組織病理損傷嚴重,表明ONFH兔存在氧化應激及骨細胞凋亡的現象。因此,抑制氧化應激及骨細胞凋亡可能是治療ONFH的潛在有效策略之一。

葛根素是一種具有高健康價值的天然物質,具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、保護心腦血管和骨修復等一系列生物活性[12]。相關研究顯示,葛根素對于激素性ONFH大鼠的壞死股骨具有良好的修復作用[13];葛根素可減弱骨間充質干細胞凋亡進而改善糖皮質激素誘導的大鼠ONFH[14]。本研究亦顯示,葛根素可抑制ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡,且葛根素劑量越高,抑制作用越明顯。本研究同先前的研究[13-14]一致,證實了葛根素對ONFH具有保護作用,但也對該結論進行了完善,即葛根素對ONFH的保護作用是通過抑制氧化應激及細胞凋亡實現的。另有研究顯示,仙靈骨葆膠囊作為臨床上常用于治療ONFH的藥物,本研究設置該藥物為陽性藥物,結果顯示,仙靈骨葆膠囊與高劑量葛根素對ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡的抑制作用差異無統計學意義。提示葛根素可能成為治療ONFH的潛在有效藥物。

近年來,越來越多的研究表明葛根素通過調控miRNA的表達來影響各種疾病的進展。如葛根素通過下調miR-196a-3p促進大鼠成骨細胞增殖和分化,進而改善骨質疏松[15];葛根素通過抑制miRNA-140-5p表達來預防糖尿病腎損傷[16]。且有研究表明在ONFH動物模型中miR-30b-5p表達降低[6]。但葛根素能否通過調控miR-30b-5p表達影響ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡的研究鮮有報道。此外,有研究顯示,miR-30b-5p可通過抑制氧化應激減輕大鼠子癇前期癥狀[17]。本研究顯示,葛根素可促進ONFH兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達,且葛根素劑量越高,促進作用越明顯,推測葛根素可能通過上調miR-30b-5p表達來抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡。為了驗證該推測,本研究在高劑量葛根素作用的基礎上再加上miR-30b-5p antagomir來干預ONFH兔,結果顯示,miR-30b-5p antagomir減弱了高劑量葛根素對ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的抑制作用。證實了猜想的正確性。

綜上所述,葛根素可能通過上調miR-30b-5p表達來抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡。葛根素抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的具體機制有待進一步深入探究。