非天然氨基酸的應用及生物合成策略

李海寧 張紅兵 耿革霞 李冉 賈振華

（1. 河北經貿大學生物科學與工程學院，石家莊 050062；2. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；3. 河北省藥品職業化檢查員總隊，石家莊 050000）

蛋白質在細胞的生理過程中發揮著重要的作用，它們可以催化生物反應，調節基因表達和免疫反應，提供結構框架，調節運輸系統等［1］。蛋白質通常由20 種天然氨基酸組成的，這些氨基酸具有不同的功能基團。然而，20 種天然氨基酸的功能基團數量和種類有限，不能滿足化學、生物科學研究和應用中對蛋白質結構和功能的多樣化需求。非天然氨基酸（unnatural amino acids，UAAs）由于其獨特的功能基團和化學性質常被插入蛋白質中用來賦予蛋白質更高的活性和穩定性、作為蛋白質探針探索蛋白質結構變化、合成抗菌藥物等。如Curnew 等［2］利用特定的正交系統將熒光性UAAs 插入丙型肝炎病毒的核心蛋白中，在不影響蛋白活性的情況下，實現蛋白的可視化。Salehi 等［3］設計合成了一種含有二苯丙氨酸的細胞穿透性多肽DipR5 可以與抗癌藥物如阿霉素、喜樹堿和姜黃素等結合使用，從而達到抗癌抗腫瘤目的。由于UAAs 廣闊的應用前景，研究人員不斷嘗試開發和改進UAAs 的合成技術。目前UAAs 主要通過化學合成法生產，但化學合成存在污染嚴重、反應步驟復雜、生產成本高和對映體選擇性差等缺點，限制了UAAs 的規模化生產。近年來，隨著生物技術的不斷變革和對環境的保護意識的增強，生物合成以其綠色高效、反應條件溫和、成本低、產率高等諸多優點得到廣泛關注。同時，隨著代謝工程和合成生物學的飛速發展，微生物細胞工廠為UAAs 的生物合成及規模化生產提供了有效策略。

本文主要介紹了UAAs 在蛋白質中的應用領域，通過它們在蛋白質探針、酶工程、多肽藥物和其他領域成功應用的實例展示了UAAs 的生物合成和應用價值，同時論述了基于代謝工程的UAAs 的生物合成策略，最后展望了在合成生物技術時代UAAs生物合成與應用面臨的挑戰和發展前景。

1 非天然氨基酸的應用

1.1 蛋白質結構和功能探針

蛋白質是生命活動存在的物質基礎，參與運輸、催化、調節等多種生命過程。定位蛋白質在體內分布，探究未知蛋白質之間的相互作用以及研究蛋白質的序列與結構功能關系等對揭示生命活動至關重要。

核磁共振（NMR）是一種常用的蛋白質結構解析方法。它可以獲得蛋白質高分辨率結構，也可以廣泛用于研究蛋白質在離體和細胞內構象和相互作用機制。但是，對于大分子量蛋白質，NMR 面臨著信號峰過多、信號峰展寬、分辨率較低等問題，這些問題會影響構象信息的獲取。為了解決這些問題，一種有效的方法是利用UAAs 進行定點標記，該方法可以顯著減少信號數目，提高NMR 信號強度，降低數據采集和分析難度［4］。其中，含氟UAAs 是比較理想的NMR 觀測對象，因為自然界中氟原子和氫原子具有相似的共價半徑、強烈的NMR 信號、無背景信號干擾，并且對蛋白質結構影響較小［5］。通過在蛋白質的關鍵位點引入含氟原子UAAs，并觀測其在蛋白質中的NMR 信號，可以獲取蛋白質在相關生命活動中的構象變化信息［4］。例如，將（2S,4S）?5?氟亮氨酸摻入乳桿菌的二氫葉酸（DHFR）中，這是第一個將含氟脂肪族氨基酸用作19F NMR 探針的例子，為含氟UAAs 作為NMR 探針分析蛋白質的結構和功能開辟了新視角。另一個常用的含氟UAAs 是三氟甲基苯丙氨酸（tfmF），它能夠被特異性引入到蛋白質的特定位點，實現蛋白質的位點特異性動態分析。Shi 等［6］應用19F 標記的tfmF 實現蛋白質的定點同位素標記，并結合NMR 方法研究了水溶性蛋白vinexinSH3 結構域和膜蛋白DAGK 的定點標記和動力學分析。同時還運用了19F tfmF 實現了大腸桿菌酪氨酸激酶的原位NMR 分析。

除了NMR 標記，熒光標記也是一種常見的蛋白質結構和功能探針。熒光標記也有助于探究生物大分子在細胞環境中的動態過程，實現細胞內生理過程的可視化。一些帶有特殊官能團的UAAs 可以在不影響蛋白質性質的前提下標記蛋白質，為研究蛋白質的功能、構象變化及細胞內蛋白質的定位開辟了一條有效的途徑。例如，通過引入熒光非天然氨基酸和融合發光蛋白，可以設計合成新型發光蛋白質探針。Yamaguchi 等［7］將熒光素酶作為Bret 供體，融合到麥芽糖結合蛋白的C 末端，并將BODIPY558 氨基苯丙氨酸插入到麥芽糖結合蛋白的結合位點附近的Tyr210 位點，作為Bret 受體。當加入麥芽糖后，熒光素酶和BODIPY558 的發射強度比提高了4.0 倍。這種通過融合發光蛋白和熒光非天然氨基酸合成的新型BRET/FRET 蛋白質探針，可以作為特定配體的生物成像和診斷檢測的有價值的工具。另一種有用的UAAs 是光交聯型非天然氨基酸，它們能夠與鄰近的氨基酸殘基產生反應，實現光的交聯反應。這種交聯反應可用來觀測動態變化的蛋白質相互作用和設計功能蛋白質，有助于生物過程的研究和可控的藥物設計［8］。Chin 等［9］將光交聯非天然氨基酸對苯甲酰基?L?苯丙氨酸（pBpa）插入蛋白質中，在紫外光激發下，pBpa 的二苯甲酮基團會與附近的C?H 鍵發生交聯，從而可以確定該氨基酸附近相互作用的伴侶蛋白信息。

1.2 提高酶催化活性和穩定性

酶是一種有效的生物催化劑，能夠以高效率和選擇性促進化學反應，近幾十年來在制藥、食品加工、生物燃料生產、農業等領域的應用日益增多，需求也隨之增長［1］。然而，天然酶作為生物催化劑的一個主要挑戰在于難以在惡劣條件下保持酶的穩定性和最佳活性，因此在酶工程中，提高酶活性、立體選擇性、穩定性、底物范圍和開發獨特功能是主要的目標。傳統上，酶工程主要由理性設計、定向進化和半理性設計三種策略來改善酶催化性能和穩定性，雖然取得了一定進展，但這種方法也僅僅局限于20 個天然氨基酸的使用。利用遺傳密碼擴展技術，將UAAs 以位點特異性或殘基特異性的方式插入蛋白質中，突破了20 個天然氨基酸的限制，可以有效改善酶的性能，提高酶活性和穩定性［10］。

UAAs 在酶工程中的應用有兩個方面引人矚目，一是對酶催化活性的提升，UAAs 可以通過改變蛋白質的立體構象、電子分布、親疏水性等因素，影響酶活性中心的形成和底物結合能力，從而提升酶活性。例如，磷酸三酯酶（PTE）可有效水解農藥中的有機磷，為了突破其催化效率，Ugwumba 等［11］用L?（7?羥基香豆素?4?基）乙基甘氨酸替換PTE中的Tyr309，發現PTE 的催化效率提高了8-11倍。這是因為L?（7?羥基香豆素?4?基）乙基甘氨酸與產物側鏈都帶有負電荷，形成了較強的靜電斥力。另一個常用于提升酶活性的UAAs 是對甲酰苯丙氨酸（pBzF4）。Li 等［12］在2018 年的研究中，用PBzF4 取代大腸桿菌高絲氨酸O?琥珀酰基轉移酶中的Phe21，使Km顯著增加。轉氨酶（TAMs）是有機合成中最有前途的手性氨基化合物的生物催化劑之一，將對苯甲酰苯丙氨酸（pBzF4）引入（R）?TAM活性中心的Phe88 殘基處，可以顯著提高酶活性［13］。二是對酶穩定性的增強，UAAs 可以通過增強蛋白質內部或外部的相互作用力，提高蛋白質對溫度、pH、有機溶劑等因素的抵抗能力，從而增強酶穩定性。例如，鹵化非天然氨基酸，特別是氟化非天然氨基酸，除被用作蛋白質探針外，還經常被用于插入蛋白質中增強酶的催化活性和穩定性。這是因為鹵原子可以形成鹵鍵，從而增加蛋白質的熱穩定性和溶劑穩定性。谷胱甘肽S 轉移酶（GST）是一種解毒酶，它能將一分子谷胱甘肽與化合物偶聯，促進其降解［10］。Parson 等［14］將大鼠GST 的4 個色氨酸殘基全部替換為5?氟色氨酸，結果表明，與未發生改變的GST 相比，Kcat增加了4 倍，Kcat/Km增加了兩倍。將3?氯酪氨酸和3?溴酪氨酸分別插入GST 中，結果顯示含有3?氯酪氨酸的GST 具有更高的熱穩定性。將對氟苯丙氨酸插入PTE 中，通過實驗發現插入對氟苯丙氨酸的PTE 表現出更好的熱穩定性，并且在65℃時仍具有顯著的活性。同樣地，將含氟非天然氨基酸如4?氟苯丙氨酸、5?氟色氨酸、3?氟酪氨酸對來自南極洲假絲酵母脂肪酶的芳香族殘基進行特異性氟化，結果表明該脂肪酶的活性周期也得到了延長。此外，將UAAs 引入金屬酶中金屬螯合的關鍵配體位置，也可以顯著改變催化性能。例如，N-δ-甲基組氨酸被結合到幾種金屬酶中，以增強其活性。N-δ-甲基組氨酸作為肌紅蛋白（Mb）中血紅素的近端配體，可以導致血紅素氧化還原電位和活性顯著增加［15］。同樣地，將N-δ-甲基組氨酸加入到修飾的抗壞血酸過氧化物酶中，也可以顯著提高抗壞血酸過氧化物酶的催化活性。

UAAs 已在酶工程中得到廣泛應用，但其發展仍受到眾多因素限制，如大量UAAs 的合成路線復雜且成本高等，因此需要進一步尋找和發展更高效的創新方法，使UAAs 得到更廣泛應用，創造出更多更穩定、更活躍、更具有化學功能的酶。

1.3 抗體藥物偶聯物（antibody?drug conjugates,ADC）

抗體是體內獲得性免疫應答的重要組成部分，對抗原具有優異的識別特異性和親和力［16］。抗體藥物偶聯物是一種將抗體與其他毒性小分子或者治療性藥物通過一定方式連接到一起的復合物。該藥物的原理是利用抗體部分特異性結合靶細胞表位的抗原，將高活性細胞毒藥物運送到靶細胞內，釋放細胞毒藥物，阻止細胞分裂，達到殺死腫瘤細胞的目的，如圖1 所示。該產品可有效提高藥物的靶向性，實現向腫瘤等病灶組織精確遞藥，降低藥物毒副作用，因此近幾年備受青睞，成為研究熱點。UAAs 因其獨特的正交偶聯性、部位特異性和低毒性被廣泛應用于ADC 生產，并產生較好的治療效果。插入蛋白質抗體中的UAAs 通常為乙酰苯丙氨酸、疊氮基甲基?L?苯基丙氨酸和疊氮賴氨酸。UAAs 帶有的酮基、疊氮基官能團可與藥物連接子發生化學反應，從而獲得藥抗比均一的ADC。Ambrx 公司的ARX788 是首個利用UAAs 開發的抗體藥物偶聯物，目前已處于臨床研究階段［17］。Kularatne 等［18］利用一種非天然氨基酸對乙酰苯丙氨酸（PAcF）定點修飾抗CXCR4免疫球蛋白G，并通過穩定的肟鍵將其與金黃色葡萄糖素偶聯，制備了一種抗CXCR4?Auristatin 抗體-藥物結合物，該ADC 能夠選擇性地消除過表達CXCR4 受體的腫瘤細胞，且無明顯毒性，有望用于治療多種轉移性惡性腫瘤。Zimmerman 等［19］建立了一個無細胞蛋白表達系統，通過定點插入優化的對疊氮甲基?L?苯丙氨酸（PAMF）來生產抗體藥物結合物，并利用疊氮-炔環加成無銅點擊化學，證明了PAMF 的定點結合修飾能夠增強藥物與腫瘤特異性的結合，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。梁學軍等［20］將非天然氨基酸pAF 引入抗人類表皮生長因子受體2（HER2）單克隆抗體分子中，并與毒性分子特異反應，制得抗HER2?ADC。該ADC 在細胞體外和動物體內實驗中對HER2 高表達的腫瘤細胞具有明顯的抑制效果。目前，基于UAAs 偶聯構建的ADC 數量占臨床試驗ADCs 的4%［21］。因此，我們相信基于UAAs 偶聯構建的ADC 會有廣闊的發展前景。

圖1 抗體藥物偶聯物及其作用原理Fig. 1 Antibody-drug conjugates and principle of action

1.4 抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）

AMP 是一類具有抗菌活性的堿性多肽物質。它們通常具有強堿性、熱穩定性和廣譜抗菌等特點。由于抗生素的濫用，細菌的抗藥性不斷增強，因此AMP 對細菌的強力殺滅作用，特別是對某些耐藥性病原菌的殺滅作用，引起了人們的關注。然而，抗菌肽在動植物體內含量極低，從動植物體內分離提取困難、耗時、成本高等問題一直是抗菌肽實現大規模生產并投入使用的最大障礙。因此，開展AMP基因工程研究具有重要意義。

AMP 是典型的陽離子和兩親性多肽。陽離子型抗菌肽通過與細胞膜上帶負電荷的成分相互作用，增加了細胞膜的通透性，破壞其穩態，導致細胞膜溶解，釋放細胞內容物，從而實現抗菌或其他抗性功能［22］。非天然氨基酸聚L?賴氨酸（PLLs）在生理條件下可生物降解并帶正電荷，已被用作抗菌劑，并且已被證明具有良好的抗菌活性。例如Pan 等［23］通過制備側鏈上含有不同亞甲基數量的PLLs 同系物（如聚 L?鳥氨酸（PLOs）、PLLs、聚 L-α,ζ 二氨基庚酸（PLHs））的星型多肽來調節抗菌劑的兩親性，從而實現最佳抗菌活性。他們隨后利用銅綠假單胞菌對星狀多肽進行了抑菌活性測試發現，非天然氨基酸聚 L?鳥氨酸對銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用,并對由銅綠假單胞菌引起的小鼠皮膚燒傷創面感染具有良好的抗菌和創面愈合作用。因此非天然氨基酸聚 L?鳥氨酸可作為抗菌肽，用于治療生物被膜的相關感染。D’Souza 等［24］將抗菌肽 BuCATHL4B中的3 條色氨酸（Trp）側鏈用非天然氨基酸 β-1?azulenyl?L?丙氨酸替換后發現，該抗菌肽不僅保持了抗菌和殺菌活性，而且還提高了與人細胞的相容性和抗蛋白酶降解的穩定性。Salehi 等［3］還設計合成了一類含有非天然氨基酸二苯丙氨酸的細胞穿透性多肽（CPPs）DipR5，它具有攜帶多種分子的能力，是一種多功能藥物傳遞系統，可以與抗癌藥物如阿霉素、喜樹堿和姜黃素等結合使用，從而起到抗腫瘤抗癌的作用。

這表明，UAAs 可以作為設計和開發新型功能多肽的有用工具。其獨特的光譜特性，以及對細胞相容性和蛋白酶抗性的顯著改善，使其可以應用于多種基礎和治療系統。隨著合成生物學和人工智能等新型交叉學科的快速發展，不僅為AMP 的設計合成提供了全新的技術平臺，也擴展了AMP 的醫藥應用前景。

1.5 其他應用

非天然氨基酸除應用于蛋白質探針、酶工程、抗體藥物偶聯物等之外，還作為手性砌塊應用于藥物前體、病毒疫苗、生物傳感器等諸多領域。本課題組研究的D?苯甘氨酸已大量用于半合成青霉素和半合成頭孢菌素等，在重要β-內酰胺抗生素的合成中，它們已成為抗生素臨床用藥的主力軍。近年來，多肽在智能納米材料開發中取得了一定的進展，從生物材料、生物傳感器到藥物輸送系統等。例如，在二肽中加入高丙氨酸或去甲丙氨酸創造了具有新晶體結構的微孔有機材料，用作藥物載體和溫室氣體的吸收劑。UAAs 插入蛋白質結構中還可作為電化學生物傳感器，左旋多巴L?DOPA 是苯丙氨酸的類似物，含有兒茶酚部分參與可逆的雙電子氧化還原過程，因此適合作為電化學標記。通過葡萄糖/半乳糖結合蛋白（GBP）來說明檢測原理，當葡萄糖結合后，GBP 發生了顯著的構象變化，表現為L?DOPA的電化學性質的變化。Zeynaloo 等［25］將電活性GBP固定在金納米顆粒修飾的聚合咖啡酸絲網印刷碳電極（GBP?LDOPA/AuNP/PCA/SPCE）上，用于直接測量血糖水平，并使用電化學活性UAAs 作為標記進行驗證。由此產生的無試劑GBP 生物傳感器表現出高度的選擇性以及對葡萄糖在微摩爾范圍內的靈敏的親和力，為新的生物傳感方法奠定了基礎。

將UAAs 插入蛋白質中，用于新型疫苗的開發也是UAAs 一種極有價值的應用。機體在受到病毒感染以及發生炎癥時會通過氧化應激反應引發自身某些蛋白質中的Tyr 殘基發生翻譯后修飾形成硝基酪氨酸和磺基酪氨酸。研究人員發現硝基和磺基在體內具有較強免疫原性，因此一些含硝基或者磺基的UAAs， 包括p?nito?L?phenylalanine（pNO2F）、3?nitro?L?Tyrosine（3?NO2Y）、p?sulfo?L?phenylalanine（pSO3F）被認為可應用于治療性蛋白疫苗的開發［26］。例如，將腫瘤壞死因子（TNF-α）中的Lys 和Tyr 定點突變成pNO2phe 后，打破了動物自身免疫耐受，產生了高效價抗體，被認為是一種有潛力的治療性蛋白疫苗。除用作治療性蛋白疫苗外，UAAs 還可用于減毒活疫苗的研發。通過在病毒復制的關鍵基因中引入提前終止密碼子構建的突變病毒，在添加UAAs 的情況下該基因仍能完整表達從而完成病毒的復制和傳代，但該病毒在正常細胞中因復制關鍵基因不能完整表達而無法復制傳代，因而是一種復制缺陷型病毒。該病毒用作疫苗時既具有減毒活疫苗免疫效果還有安全性高的優點，因而是一種較為理想的活病毒疫苗［27］。具有部分UAAs 的應用如表1所示。

表1 非天然氨基酸的應用Table 1 Applications of unnatural amino acids

2 非天然氨基酸的生物合成

UAAs 具有巨大的應用潛力，因此其合成方式備受關注。目前，其合成方法主要有化學法和生物法兩大類。化學法作為傳統的合成方法，存在反應條件嚴苛、反應步驟復雜、原料成本高等問題。相比之下，生物法具有反應條件溫和、能耗低、對映體選擇性高等優點，更具吸引力。隨著對代謝工程和合成生物學領域的不斷發展，通過優化微生物工程菌整個代謝網絡，提高其性能和穩定性，利用進化代謝和全局調控提高其生產能力，將其轉化為生產可用的工程菌是當前生物合成技術研究熱點［33］。

2.1 靜態調控優化策略

代謝工程的目標是通過改變和調控宿主體內的關鍵代謝途徑或引入新的代謝途徑來提高目標產品的產量等［36］。當前已有研究在大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等底盤生物中成功構建UAAs 的生物合成途徑［37］。如4?羥基異亮氨酸（4?HIL）是有效預防和治療Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的理想潛在藥物［38］，其生物合成是以L?異亮氨酸和α-酮戊二酸為前體，由L?異亮氨酸雙加氧酶（L?isoleucine dioxygenase，IDO）催化而成。然而在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等底盤細胞中均不含IDO，因此應首先在菌株中表達外源IDO構建4?HIL 合成途徑。Shi 等［39］在L?異亮氨酸產生菌C. glutamicum中異源表達IDO 基因，并引入4?HIL合成途徑，在不添加L?異亮氨酸和α-酮戊二酸的情況下實現了從葡萄糖中從頭合成4?HIL，并通過改善底物供應和IDO 活性增強4?HIL 的合成效率，使4?HIL 產量提高到0.069 47 mol/L。Umutumwa 等［40］克隆了來自蘇云金芽孢桿菌的IDO，實現了其在E.coliBL21（DE3）中的異源表達，然后通過對酶的結構及反應條件進行優化，反應32 h 后4?HIL 產量達0.077 3 mol/L。

合理調控關鍵節點處的代謝分配是提高目標產物生物合成產量的關鍵。5?氨基乙酰丙酸（5?ALA）是一種多功能植物生長調節物質，可促進植物生長和提高作物產量，在醫藥領域，可以用于癌癥診斷和治療［41］。5?ALA 的C5合成途徑是以L?谷氨酸為前體合成的。研究表明，谷氨酰tRNA 還原酶（GluTR，由hemA基因編碼）和谷氨酰?1?半醛氨基轉移酶（GSA?AM，由hemL基因編碼）是5?ALA C5合成途徑的關鍵酶［42］。通過對5?ALA 代謝通路的關鍵酶基因進行調控，可有效提高5?ALA 的產量。Kang等［43］將來自鼠傷寒沙門氏菌的hemA基因的N 端編碼Thr?2 和Leu?3 氨基酸之間插入兩個編碼賴氨酸的密碼子，進一步在E. coli中過表達突變型基因，5?ALA的產量提高到0.18 g/L。另外，魏敏華等［44］在研究影響5?ALA 的關鍵因素時發現，敲除編碼L?谷氨酸轉運蛋白的基因阻斷胞內L?谷氨酸的外排，同時將5?ALA 合成關鍵酶GluTR 和GSA?AM 按比例組裝至DNA 腳手架上，以減小中間代謝產物的傳遞空間，可使5?ALA 產量提高35.3%。

此外，還有許多代謝工程策略可以用來提高UAAs 的合成效率和產量，如阻斷產物分解代謝、敲除競爭性旁路、解除轉錄和反饋抑制以及調節輔因子供應和產物轉運等。例如，L?2?氨基丁酸（L?ABA）可通過蘇氨酸脫氨酶催化L?蘇氨酸生成α-酮丁酸（2?KB），再經亮氨酸脫氫酶催化而制得。通過定點突變高絲氨酸脫氫酶基因和蘇氨酸脫氫酶基因，可有效解除L?蘇氨酸和L?異亮氨酸的反饋抑制，保證L?蘇氨酸的充足供應，從而提高L?ABA 的產量［45］。其他常見UAAs，如L?高絲氨酸、鳥氨酸、反式?4?羥基脯氨酸、5?羥基色氨酸等也已通過運用上述代謝工程策略使生產效率和產量成功得到提高，其合成途徑如圖2 所示。

圖2 非天然氨基酸的生物合成途徑Fig. 2 Biosynthetic pathway of UAAs

2.2 動態調控優化策略

動態調控作為合成生物學的一項重要生物技術具有顯著的技術優勢和細胞經濟性［33］。傳統的靜態調控通過對產物合成途徑中的關鍵基因過表達或旁路競爭途徑相關基因進行敲除，使代謝流精準高效的流向產物合成途徑。這種調控策略雖然在一定程度上可以提高產物產量，但同時可能會抑制細胞內代謝活動，影響細胞正常生長［46］。此外，異源途徑的引入也會給細胞帶來負擔和毒性，降低產物合成速率和得率。因此需要更先進的調控策略，在保證細胞正常生長的前提下，優化目標產物的生產速率和得率。

動態調控策略是指通過感知細胞內外各種信號，動態調節蛋白質或基因的表達水平，從而實現對代謝流的精確控制，從而獲得最佳的目標產品合成效率。根據不同的調控策略特點，動態調控可分為代謝物響應、群體感應響應、環境響應和蛋白質水平調控四種類型［47］。近年來，在UAAs 的生物合成中已成功應用了這些策略。代謝物響應的核糖開關可以感知細胞內外某些代謝物或產物的濃度變化，來調節相關基因或蛋白質的表達水平。這種策略可以實現對代謝流量的實時反饋和自適應調節，具有反應時間快，對細胞負擔小及靈活性高的特點［48］。例如，來文梅等［49］為提高4?HIL 的產量，將Lys?OFF核糖開關整合到Lys 合成途徑的關鍵基因dapA序列上游，動態弱化Lys 的合成，使Lys 的產量降低46.7%。同時利用Ile 激活型傳感器Lrp?PbrnFEN 動態激活4?HIL 合成途徑中ido基因的表達。最后，利用強啟動子PbrnFE7 動態控制增強α-酮戊二酸和O2供應途徑中關鍵基因odhI 和vgb的表達，通過這種多層次的動態調控，使4?HIL 產量高達0.166 mol/L。Zhou 等［50］在巴氏梭菌中設計改造了一種高效的甘氨酸抑制型核糖開關，并將其整合到5?ALA C4合成途徑中，使其能夠感知前體甘氨酸濃度來動態調控5?ALA 脫水酶的表達，從而實現了5?ALA 的產量提升。

群體感應系統（QS）是細菌用于監控自身群體密度的環境信號感受系統。這種策略可以通過感知細胞群體密度的變化，來調節相關基因或蛋白質的表達水平，具有信號傳遞迅速、調控效果高和穩定性高等特點。隨著合成生物學的大力發展，QS 的應用研究在動態調控領域受到廣泛關注。Gu 等［51］利用具有激活和抑制雙重調控功能的Eas?QS 系統，構建了一種雙功能動態調控開關，并將其用于動態調控5?ALA 的生物合成，實現了前期菌體快速生長，后期快速積累產物。最終，使5?ALA 的產量比靜態調控提高12 倍。

總之，動態調控在UAAs 的合成中具有顯著優勢，能實現對代謝流量的精確控制和優化分配。目前，動態調控還存在一些挑戰和局限性，如調控網絡的復雜性、生物元件的匱乏等。隨著合成生物學的不斷進步，相信動態調控將在UAAs 的生物合成中發揮更大的作用。4?HIL 和5?ALA 的動態調控如圖3 所示。

圖3 4-HIL 和5-ALA 的動態調控Fig. 3 Dynamic regulation of 4-HIL and 5-ALA

2.3 發酵優化策略

在生物生產中，微生物的發酵策略是影響產品產量和糖酸轉化率的重要因素之一［30］。順式?4?羥基-脯氨酸（CHOP）和反式?4?羥基-脯氨酸（THOP）是兩種具有很高藥用價值的手性結構UAAs，近年來，其生物合成受到廣泛關注。張博文等［52］和李強等［53］分別構建了CHOP 和THOP 的細胞工廠，并對其進行了發酵優化，實現了UAAs 的高效生產。張博文等［52］進行發酵優化時發現，在2.5 g/L 的底物濃度下，CHOP 產量達到最大值，隨后開始下降。為了避免底物濃度過高抑制細胞活性，他們后期采用分批補料的方式使底物濃度在合適的范圍內，通過這種發酵策略，在最優發酵條件下發酵60 h 后，CHOP 產量達到120 mg/L，較發酵優化前得到明顯提升。李強等［53］為了評估THOP 細胞工廠的生產性能，也采用了分批補料的方式，在5 L 發酵罐中進行發酵實驗時發現，隨著發酵時間延長，細胞生物量逐步增加，最終OD600達到70，在進行葡萄糖分批補料發酵40 h 后，THOP 產量達到48.6 g/L，糖酸轉化率和平均生產強度分別達到21.6%和1.22 g/（L·h）,為THOP 的發酵生產提供了理論支持。部分常見的UAAs 的生物合成策略如表2 所示。

表2 非天然氨基酸的生物合成Table 2 Biosynthesis of UAAs

3 總結與展望

UAAs 是一類在醫藥、農藥、食品、材料等眾多領域具有重要價值和廣闊前景的化合物。尤其在合成蛋白質中，它們打破了20 種天然氨基酸的限制，賦予了蛋白質更穩定的性能和更廣闊的應用。UAAs在酶改造、蛋白質藥物、生物傳感器等領域的應用效果令人驚嘆。然而，UAAs 的合成仍面臨著巨大的挑戰。目前，UAAs 的生產方式主要依賴化學法，這種方法不僅污染嚴重且導致UAAs 的價格昂貴。隨著生物技術的突破和合成生物學的發展，UAAs 的生物合成已取得了顯著的進展。通過對代謝工程靜態和動態調控策略深入研究以及核糖開關、群體感應系統、轉錄因子-啟動子等技術手段的應用，使UAAs 的生產效率和產量得到大幅提升。

但總體來說，當前動態調控技術仍然存在一些不足和局限性，如動態調控元件種類少、響應范圍有限、底物譜和響應閾值窄等。因此利用動態調控策略合成UAAs 還需要繼續深入研究和優化。此外，目前僅有少數UAAs 的代謝途徑得到解析和利用，因此需要借助合成生物學、蛋白質工程、轉錄組學等學科進行深入研究來進一步挖掘更多UAAs 的代謝途徑和關鍵酶。除此之外，將UAAs 位點特異性插入到蛋白質中的遺傳密碼擴展技術也有待發展和突破，此技術仍存在密碼子和相互正交RS/tRNA 對匱乏和插入UAAs 種類限制等挑戰。目前，國內UAAs 的市場需求還很大，應充分挖掘和利用UAAs的生物合成途徑及其在蛋白質中的應用潛力。我們相信，隨著合成生物學、生物化學和理性設計等技術手段的不斷完善和創新，高效綠色的UAAs 生物合成路線將會得到廣泛應用，同時計算模擬輔助遺傳密碼擴展技術也會不斷成熟和優化，將UAAs 更多地應用到蛋白質及多肽藥物中。