S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究進展

何家樂 董敏

（天津大學化工學院 天津大學系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072）

S?腺苷?L?甲硫氨酸（S?adenosyl?L?methionine，SAM）是除三磷酸腺苷（ATP）外，被有機體應用最廣泛的輔因子［1］。SAM 分子中的硫原子通過3 個C?S 鍵分別與甲基、5'?脫氧腺苷（5'?deoxyadenosine，5'?dA）和3?氨基?3?羧基丙基（3?amino?3?carboxy?propyl,ACP）相連，由于形成的锍鎓結構，這3 個C?S鍵都不穩定［2］。有機體中不同的SAM 依賴酶可以選擇性地裂解其中不同的C?S 鍵來催化各種生化反應（圖1）。SAM 最常見的應用方式是作為甲基轉移酶的甲基供體［3］。另外，SAM 自由基酶可以催化SAM中C5'?dA?S 均裂，產生5'?脫氧腺苷自由基（5'?dA·），從而引發底物發生一系列化學上困難的轉化［4］。與甲基和5'?dA 的廣泛應用相比，目前僅有少量利用SAM 中ACP 基團的酶被報道，本文中將這一類酶統稱為ACP 利用酶（ACP utilizing enzyme），文中主要介紹當前已發現的ACP 利用酶催化的反應類型、反應機制和含有ACP 修飾的對應產物的生理功能。

圖1 SAM 依賴酶催化的3 種不同的C-S 鍵斷裂反應Fig. 1 Three kinds of C-S bond cleavage reactions of SAM dependent enzymes

目前已知的ACP 利用酶從功能上主要分為兩類：第一類ACP 利用酶能夠以SAM 作為ACP 供體，將ACP 基團轉移至相應的底物，如RNA、蛋白質及各類小分子代謝產物，故稱之為ACP 轉移酶。ACP轉移反應從機制上有極性機理和自由機理兩種不同的反應機制（表1）。第二類ACP 利用酶則是催化SAM 的ACP 基團發生分子內的環化反應，生成氨基環丙基?1?甲酸（1?aminocyclopropane?1?carboxylic acid，ACC）或氮雜環丁烷2?甲酸（azetidine 2?car?boxylic acid，AZC），ACC 和AZC 可以作為構建模塊被引入非核糖體肽或聚酮類天然產物中，所以將其稱為ACP 環化酶。

表1 ACP 利用酶總結Table 1 Summary of ACP utilizing enzymes

1 ACP 轉移酶

ACP 轉移酶的反應機制有極性機理和自由基機理兩種。由于N、O 原子親核性較強，目前發現的N、O 上的ACP 轉移反應都是通過極性機理進行的。同時電子云密度較高的烯胺碳原子上的ACP 轉移反應也是通過極性機理進行。組氨酸咪唑環的C2 位由于電子云密度低，親核性相對較差，所以該位置上的ACP 轉移反應是目前報道的唯一通過自由基機理完成的ACP 轉移反應［19］。

1.1 極性機理的ACP轉移酶

1.1.1 修飾RNA 的ACP 轉移酶 懷丁苷（wybuto?sine，yW）是一種被高度修飾的核苷，特異地存在于真核生物tRNAPhe的37 位［20］。yW 可以通過其體積龐大的疏水結構穩定tRNAPhe反密碼環的構象，同時能夠維持苯丙氨酸（Phe）閱讀框的穩定，提高翻譯過程的準確性［21］。yW 在酵母中的生物合成過程如下：首先SAM 依賴的RNA 甲基轉移酶Trm5 催化G?37N1 上的甲基化，生成m1G?37［22］。隨后SAM 自由基酶TYW1 催化形成4?去甲基丫苷（4?demethylwyosine,imG?14）［23］。然后SAM 依賴的ACP 轉移酶TYW2催化imG?14 C7 上的ACP 烷基化［24］。接著甲基轉移酶TYW3 催化N4 上的甲基化。最后由雙功能酶TYW4 催化ACP 側鏈上羧基的甲基化和氨基的甲氧羰基化，最終得到yW［24］（圖2?a）。原核細胞中不存在yW，但Umitsu 等［5］發現兩種來源于古細菌的TYW2 同源蛋白MjTYW2 和PhTYW2 在體外具有與酵母TYW2 相同的ACP 轉移活性。晶體結構表明TYW2 在結構上與I 類SAM 依賴的甲基轉移酶相似［25-27］，且TYW2 中結合SAM 腺苷和核糖部分的保守基序也與I 類甲基轉移酶類似，但二者結合ACP 基團的方式則顯著不同。在I 類甲基轉移酶Trm5 中，SAM 的ACP 基團結合在由DX3GXG 基序所形成的腔（M 腔）內，而甲基朝向底物結合口袋一側［28］。TYW2 中同樣存在由DX3GXG 形成的M腔，但TYW2 中的M 腔被一個空間位阻很大的氨基酸殘基所占據，在不同種屬的TYW2 中，該基團可以是His 或Tyr。所以ACP 基團無法進入TYW2 的M 腔，而是結合在由MXSX2NX3R/K 基序形成的A腔中。正是這種特殊的ACP 基團結合方式，使得TYW2 具有了ACP 轉移酶的活性［5］。

圖2 參與RNA 轉錄后修飾的ACP 轉移酶TYW2（a）, Tsr3（b）和YfiP（c）Fig. 2 ACP transferase TYW2 (a), Tsr3 (b) and YfiP (c) involved in RNA modification

真核生物核糖體小亞基的18S rRNA 中存在保守的N1?甲基?N3?（3?氨基?3?羧基丙基）-假尿嘧啶（m1ACP3ψ）修飾［29］。以酵母為例，該修飾的生物合成步驟分為三步：首先18S rRNA 的尿苷U?1191被小核仁核糖核蛋白顆粒（snoRNP）催化轉化為假尿嘧啶（ψ-1191）［30］，然后RNA 甲基轉移酶Nep1催化ψ-1191 嘧啶環上N1 的甲基化反應，生成m1ψ-1191［31-32］，最后由Tsr3 催化m1ψ-1191 嘧啶環上N3的ACP 轉移反應，生成最終產物m1ACP3ψ［6］（圖2?b）。其中，Tsr3 是SAM 依賴的ACP 轉移酶，生成產物m1ACP3ψ 的同時，將SAM 轉變為5'?甲基硫代腺苷（5'?methylthioadenosine，MTA）。Tsr3 也能夠接受尿苷U 作為底物，催化其N3 上的ACP 轉移反應，生成ACP3U 修飾［33］。m1ACP3ψ 與18S rRNA 的成熟過程有關，敲除酵母中Tsr3基因，會導致20S rRNA的積累［34］。Tsr3 含有D/EXS/TW（DTW）保守基序，該基序對于ACP 轉移活性至關重要［6］。通過解析來源于古細菌中Tsr3 同源蛋白VdTsr3 和SsTsr3 的晶體結構發現，Tsr3 在結構上與SPOUT 類RNA 甲基轉移酶類似［35］。Tsr3 和Tyw2 在結構上的相似性很低，但采用了相似的策略來結合SAM 以保證ACP轉移反應的發生，而非更常見甲基轉移反應。在Tsr3 中SAM 的甲基處在不利于反應的位置上，而ACP 基團處于更有利反應的位置。RNA 甲基轉移酶Trm10 與Tsr3 結構相似，但Trm10 結合SAM 的方式與Tsr3 正相反，在Trm10 中，SAM 的ACP 基團被包埋在蛋白內部，而甲基部分暴露于底物RNA 的結合位點附近［35］。Tsr3 可能是由甲基轉移酶進化而來，通過改變SAM 在活性口袋中的結合方式而獲得了ACP 轉移能力。

大腸桿菌的多種tRNA 中都含有ACP3U 修飾［36］，最近，Meyer 等［7］揭示了ACP3U 生物合成的酶學機理。來源于大腸桿菌的YfiP 是Tsr3 的同源蛋白，但大腸桿菌小核糖體亞基RNA 中并沒有m1ACP3ψ 或ACP3U 兩種轉錄后修飾，而是在多種tRNA 可變環上都含有ACP3U?47 修飾［37］。Meyer等［7］發現YfiP 能夠將SAM 中的ACP 基團轉移到tRNA 47 位尿嘧啶核苷的N3 上，生成tRNA 的ACP3U 修飾（圖2?c）。YfiP 序列中也含有D/EXS/TW（DTW）保守基序［6］。YfiP 及其同源蛋白在N 端區域中都存在用于結合鋅離子的保守基序——CX2CX6CXC，實驗表明YfiP 是一個鋅結合蛋白，且對應的結合域是活性必需［7］。大腸桿菌tRNA ACP3U修飾的生理學意義目前并不清楚。哺乳動物tRNA中同樣存在ACP3U 修飾，例如tRNATyrD 環中的ACP3U20 和tRNAAsn的ACP3U20a［38］。人類基因組中的DTWD1 和DTWD2 中也存在DTW 結構域，Li 等［38］發現DTWD1 和DTWD2 都能夠合成ACP3U，但二者對于tRNA 的底物選擇性不同。DTWD1 或DTWD2單敲除導致細胞生長減緩，而DTWD1?DTWD2 雙敲除則導致嚴重的生長缺陷，表明ACP3U 修飾在哺乳動物細胞中具有更為重要的生理學意義。

1.1.2 植物煙草胺合酶、古細菌熱煙草胺合酶和細菌類煙草胺合酶 煙草胺（nicotianamine，NA）是一種在植物中廣泛存在的金屬螯合劑［39］，對植物體中Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni3+、Co2+等金屬離子的穩態至關重要［40-41］。金屬離子只有與NA形成絡合物，才可以實現其在植物體內的長距離運輸［42］。同時，NA 也是植物鐵載體的生物合成前體［43］，植物釋放鐵載體到根際土壤中，鐵載體能夠與Fe3+絡合，使Fe3+以絡合物的形式被植物體吸收［44］。煙草胺合酶（NA synthase，NAS）負責NA 的生物合成，NAS 利用了三分子SAM 的ACP 基團合成NA，相應的生成三分子的MTA，其中一分子ACP 環化，形成氮雜環丁烷2?甲酸（AZC）結構［8,45］（圖3?a）。與其他的ACP 轉移酶相比，NAS僅以SAM 作為底物，沒有其他額外的ACP 受體，而且能夠催化連續兩次的ACP 轉移反應，并且NAS還兼有ACP 環化酶和ACP 轉移酶的特征。nas基因并非植物所獨有，在真菌和古細菌中同樣發現了nas的同源基因［46］。Dreyfus 等［9］研究了來源于熱自養甲烷嗜熱桿菌的NAS 同源蛋白MtNAS，然而，MtNAS 的催化產物并非NA，而是將NA 中AZC 部分替代為Glu 的NA 類似物，該化合物被稱作熱煙草胺（thermoNicotianamine，tNA）。tNA 由MtNAS 催化兩分子SAM 和一分子的Glu 合成。通過研究MtNAS 與底物復合物的晶體結構發現，MtNAS 通過同一個活性位點（S1）催化兩次ACP 轉移反應。首先Glu 與SAM 在S1 位點形成中間體Glu1?AP2，而后該中間體被自發地轉入更深的S2?S3 位點。第二分子SAM 進入S1 位點后發生第二次ACP 轉移反應，生成最終產物tNA（Glu1?AP2?AP3）［47］（圖3?b）。

圖3 煙草胺合酶（a）、熱煙草胺合酶（b）與類煙草胺合酶（c）催化的反應Fig. 3 Reactions catalyzed by NAS (a)、MtNAS (b) and CntL (c)

Ghssein 等［10］進一步在細菌中尋找NAS 同源基因，成功發現了來源于金黃色葡萄球菌的cntL。CntL 與NAS 僅有12%的序列相似性，親緣關系較遠，但CntL 與NAS 和MtNAS 具有相似的結構。CntL參與staphylopine 的生物合成，其生物合成通路如下［10］：首先，組氨酸消旋酶CntK 催化L?His 轉化為D?His；然后CntL 催化SAM 的ACP 基團轉移到D?His 的α-氨基氮原子上，形成中間體xNA；最后，CntM 催化xNA 與丙酮酸（pyruvic acid, PA）的還原縮合，生成最終產物staphylopine 同時消耗一分子NADPH（圖3?c）。此后在銅綠假單胞菌和鼠疫桿菌中分別發現了CntL 的同源基因。在鼠疫桿菌中，CntL 參與yersinopine（L?His?ACP?PA） 的生物合成，該化合物與staphylopine（D?His?ACP?PA）的區別僅在于His 部分的構型不同［48］。鼠疫桿菌中缺少CntK，故CntL 以L?His 作為ACP 基團受體。而在銅綠假單胞菌中，CntL 參與pseudopaline（L?His?ACP?KGA）的生物合成，pseudopaline 由L?His、ACP 和α-酮戊二酸（KGA）構成［49］。Laffont 等隨后在膠凍樣類芽孢桿菌中發現了D?His?ACP?KGA 的存在，將其命名為bacillopaline［50］。這些化合物統稱為類NA 金屬載體。病原微生物侵染宿主后，宿主會通過營養免疫產生對病原微生物的營養脅迫，而銅綠假單胞菌等病原微生物，通過產生類NA 金屬載體恢復對Fe2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子的吸收［51］，因此可以開發以CntL 為靶點的新型抗生素。

1.1.3 其他極性機理的ACP 轉移酶 Nocardicin A是由放線菌產生的單環β-內酰胺類抗生素，SAM 依賴的ACP 轉移酶NAT 將SAM 的ACP 基團轉移到nocardicin E 的酚羥基上，得到isonocardicin A，然后再由異構酶催化其ACP 側鏈中Cα異構化，得到最終產物Nocardicin A［13］（圖4?a）。NAT 的ACP 受體在結構類似于兒茶酚O?甲基轉移酶底物。NAT 與兒茶酚O?甲基轉移酶二者之間的系統發育關系和造成二者活性差異的結構基礎還有待進一步研究。

圖4 其他極性機理的ACP 轉移酶Fig. 4 ACP transferases with polar mechanism

甜菜堿脂（betaine lipids）是磷脂酰膽堿的類似物，其化學結構為二酰基甘油?N,N,N?三甲基高絲氨酸（DTGS）。甜菜堿脂能夠幫助細菌、真菌和植物應對環境中磷酸脅迫。其生物合成過程分為兩步［14］：首先BtaA 將SAM 中的ACP 基團轉移到二酰甘油（DAG）的羥基上，生成二酰甘油高絲氨酸（DGHS），而后甲基轉移酶BtaB 催化DGHS 高絲氨酸側鏈N 原子上連續三次的甲基轉移反應，生成產物DTGS（圖4?b）。很多BtaA 同源蛋白的N 端都含有12-15 個堿性和疏水的氨基酸殘基，且C 端含有一段延展的寡肽。這兩個結構域可能通過形成兩親性的α-螺旋將BtaA 錨定在細胞膜上，且N 端結構域中的堿性氨基酸殘基能夠與帶負電荷的生物膜形成穩定的靜電相互作用［14］。考慮到甜菜堿脂的主要生理作用是在磷酸脅迫的環境下替換生物膜中的磷脂，BtaA 結合在生物膜上的特點也是與其功能相適應的。

在香豌豆種子中，主要存在兩種異惡唑啉酮衍生物：2?（3?氨基?3?羧基丙基）?異惡唑啉?5?酮（ACI）和β-（異惡唑啉?5?酮?2?基）?L?丙氨酸（BIA），二者的區別僅在于側鏈上相差一個亞甲基。其中BIA 由胱氨酸合酶催化異惡唑啉?5?酮和O?乙酰?L?絲氨酸合成［52］，雖然ACI 與BIA 結構相似，但二者的生物合成過程有很大區別。ACI 中的2?氨基丁酸側鏈來源于SAM 而非L?高絲氨酸（圖4?c）。利用從香豌豆種子的部分純化的粗酶，可以實現ACI 的體外生物合成，該過程依賴Mg2+和ATP 的存在［53］，目前已知的利用SAM 中ACP 基團的酶中，還沒有依賴Mg2+和ATP 的例子。但該酶的編碼基因還未知，其催化機理有待進一步的研究。

盤基網柄菌產生的化合物discadinine 中也含有來源于SAM 的ACP 側鏈。Discadinine 是一種腺嘌呤衍生物，能夠抑制盤基網柄菌自身孢子的萌發。盤基網柄菌的細胞提取物可以催化SAM 的ACP 基團轉移到N6?（Δ2?異戊烯基）?腺嘌呤的N3 上，生成產物discadinine［54］（圖4?d）。Discadinine 合酶的編碼基因也依然未知。

1.2 自由基機理的ACP轉移酶（非經典SAM自由基酶）

白喉酰胺（diphthamide）是真核生物和古細菌蛋白質翻譯延伸因子EF2 上特定組氨酸（histidine，His）殘基的翻譯后修飾［55］，EF2 參與核糖體蛋白的翻譯過程，通過水解GTP 催化核糖體在mRNA 上的移位［56］。白喉毒素能夠特異性識別白喉酰胺，并催化白喉酰胺N1 上的ADP?核糖化，該反應導致EF2 失活，影響宿主細胞中蛋白質的合成［57］。在古細菌中，Dph2 催化白喉酰胺生物合成的第一步反應，Dph2 以SAM 作為ACP 供體，通過自由基機理催化EF2 組氨酸殘基ACP 烷基化［15］。Dph2 屬于SAM 自由基酶家族，SAM 自由基酶是迄今發現最大的酶家族之一。其分子中都含有至少一個［4Fe?4S］簇，通過還原態的［4Fe?4S］簇向SAM 中傳遞電子，使SAM 中C5'?dA?S 均裂，產生5'?脫氧腺苷自由基（5'?dA·），而5'?dA·進一步攫取底物上的氫原子，產生5'?dA和底物自由基，利用自由基機理實現底物的轉化［4］。由于Dph2 還原裂解SAM 的Cγ,Met?S 而不是C5'?dA?S，且序列中不含一般的SAM 自由基酶的保守半胱氨酸基序所以被稱為非經典SAM 自由酶。

Dong 等［58］通過快速冷凍淬滅（RFQ）捕捉Dph2 的反應中間體，并用電子順磁共振（EPR）和電子-核雙共振（ENDOR）對捕捉到的反應中間體進行表征，提出了Dph2 催化EF2 的His 殘基C2 位ACP 烷基化反應的酶學機理。首先，Dph2 鐵硫簇通過向SAM 中Cγ,Met傳遞兩個電子，形成MTA 和有機金屬中間體I，在底物EF2 存在下，有機金屬中間體I 中的Cγ,Met?Fe 均裂釋放ACP 自由基，ACP 自由基與EF2 上His 反應，生成有機自由基中間體II。中間體II 失去一個質子和一個電子后，最終形成ACP 修飾的His 殘基（圖5）。

圖5 非經典SAM 自由基酶Dph2 的催化機理Fig. 5 Catalytic mechanism of noncanonical radical SAM enzymme Dph2

2 ACP 環化酶

目前發現的ACP 環化酶主要是催化SAM 的ACP 基團分子內環化，生成ACC 和AZC 兩種小分子。PLP 依賴酶SbzP 雖然不能將ACP 基團環化為ACC或AZC，但能夠催化ACP 與β-NAD 的3+2 環化且SbzP 與ACC 合酶機理相近，故將SbzP 歸于此類討論。

2.1 ACP自身的環化反應

2.1.1 植物及細菌ACC 合酶 氨基環丙基?1?甲酸（ACC）是植物激素乙烯的生物合成前體［59］，ACC由ACC 合酶（ACC synthase，ACS）以SAM 為前體催化合成［17］。ACC 氧化酶進一步將ACC 轉化生成乙烯［60］。因為乙烯能夠促進果實成熟、花瓣和葉片脫落，這也導致了果蔬、鮮花的儲運過程中的大量損失，所以開發ACC 合酶抑制劑能獲得更好的經濟效益。ACS 是一種PLP 依賴酶，其催化機理如下［61］：（1）ACS 活性位點內保守的賴氨酸（Lys）殘基的ε-氨基與PLP 的甲酰基脫水縮合，此時PLP 通過C=N鏈接到酶上，形成“內部醛亞胺”。（2）SAM 分子中甲硫氨酸（Met）的α-氨基的親核進攻“內部醛亞胺”，使其與PLP 之間形成“外部醛亞胺”，而Lys ε-氨基重新游離出來。（3）Lys ε-氨基進攻SAM中Met 的α-碳原子，形成共振雜化的碳負離子中間體，即“醌型中間體”。（4）“醌型中間體”恢復到芳香結構，引發一系列的電子傳遞，最終導致甲硫氨酸中Cγ?S 鍵的斷裂，MTA 釋放。（5）去質子化的Lys ε-氨基進攻PLP 的C4'，重新生成“內部醛亞胺”，產物ACC 被釋放出來，完成一個催化循環（圖6?a）。

圖6 ACC 合酶的催化機理及其他ACP 環化酶催化的反應Fig. 6 Catalytic mechanism of ACS and reactions catalyzed by ACP cyclases

廣南霉素（guangnanmycins）由非核糖體肽合酶-聚酮合酶系統（NRPS?PKS）催化合成，其分子也含有ACC 結構單元。雖然ACC 合酶在種子植物中廣泛存在，但在細菌中并無ACC 合酶同源基因發現。Pan 等［62］發現了廣南霉素生物合成基因簇中GnmY具有ACC 合酶的活性。序列分析表明，GnmY 屬于PLP 依賴的天冬氨酸轉氨酶超家族，與植物來源的ACC 合酶僅有較低的序列相似性。GnmY 是首次報道的細菌來源的ACC 合酶。

大腸桿菌素（colibactin）是一種由大腸桿菌產生的基因毒素，常見于結腸癌和腸炎患者的病理組織中［63］，其分子內的環丙基是一種具有高反應活性的DNA 烷化劑，能夠導致DNA 損傷［64］。大腸桿菌素的生物合成過程中同樣也利用到了SAM 的ACP基團形成ACC 結構，但與廣南霉素生物合成中先利用SAM 生成ACC，再將ACC 作為結構組件整合到廣南霉素骨架中的機理不同，參與大腸桿菌素生物合成的非核糖體肽合酶ClbH 能夠直接活化SAM 并將其整合到自身的肽酰載體蛋白（PCP）結構域上［65］。Zha 等［65］證明了SAM 是ClbH?A2 結構域的底物，并通過質譜確認了SAM 能夠共價連接到ClbH 的PCP 結構域上。連接在ClbH?PCP 上的SAM 利用其ACP 基團的氨基與來自上游的生物合成中間體形成酰胺鍵以后，由聚酮合酶ClbI 負責SAM 環化形成ACC 結構（圖6?b）。同樣是利用SAM 在天然產物中引入ACC 結構，廣南霉素和大腸桿菌素的生物合成分別代表了兩種不同的策略。不依賴PLP 的ClbI 如何催化ACP 環化的，它與ACC 合酶的催化機理有何不同，這些問題還有待深入研究。

2.1.2 AZC 合酶 Azetidomonamides（ADA）是一類來源于銅綠假單胞菌的生物堿，其分子中含有獨特的氮雜環丁烷的結構。Hong 等［18］鑒定出ADA 的生物合成的基因簇，并發現SAM 依賴酶AzeJ 能夠催化SAM 中ACP 基團的分子內環化反應，生成MTA和氮雜環丁烷2?甲酸（AZC）（圖6?c）。AzeJ 的同源基因分布廣泛，根據AzeJ 的同源酶可能發現更多的含有AZC 結構的天然產物。然而，AzeJ 同源基因在植物中并不存在，但多種植物中都存在AZC，植物中的AZC 起源還有待進一步研究［66］。

Vioprolides 是一種由紫色孢囊桿菌產生的非核糖體肽，由于具有很強的細胞毒性和抗真菌活性［67］。其中Vioprolides A 和Vioprolides C 中含有特殊的4?甲基氮雜環丁烷羧酸（MAZ）結構。Yan 等［68］發現VioH 和VioG 負責MAZ 的生物合成。VioH 能夠催化SAM 發生分子內環化，生成AZC，AZC 再被VioG 催化生成MAZ［18］。吲哚類生物堿okamarine B、okamarine D 中的氮雜環丁烷結構，由α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶OkaE 催化線性結構的前體分子內環化而來［69］。而多氧霉素中氮雜環丁烷結構以異亮氨酸為前體合成［70］，VioH 和AzeJ 代表了一種新的氮雜環丁烷的生物合成策略。VioH 具有與I 類甲基轉移酶類似的結合SAM 的保守基序。VioH 與I 類甲基轉移酶結構上有何區別與聯系，哪些關鍵的氨基酸殘基決定了VioH 獨特的催化活性，這些問題還有待進一步研究。

2.2 ACP參與的環化反應

Altemicidin 是一種由鏈霉菌產生的具有抗腫瘤活性的化合物，其結構中含有特殊的6?氮雜四氫茚骨架［71］。Barra 等［16］發現SbzP 可以利用β-NAD 和SAM 催化合成Altemicidin 中的6?氮雜四氫茚骨架結構。與植物ACS 一樣，SbzP 也是一種PLP 依賴酶，且同樣利用了SAM 分子中的ACP 基團，并產生MTA。SbzP 的催化過程中同樣也包括，“內部醛亞胺”和“外部醛亞胺的”和“醌型中間體”生成，與植物ACS 合酶不同，SbzP 隨后催化SAM 中Met的Cβ的去質子化從而導致MTA 的釋放并形成β，γ-不飽和醌，該結構中的Cγ由于共軛而具有良好的親核性，Cγ進攻β-NAD 中吡啶環的C4 位，形成中間體I。隨后活性位點內Lys 殘基進攻PLP 的C4'位使中間體I 的Cβ重新質子化，β-NAD 中吡啶環的C5進攻Cα合成第二個C?C 鍵，最后環化產物釋放，酶的活性口袋內重新形成“內部醛亞胺”（圖6?d）。酶促反應動力學表明，SbzP 以乒乓機制催化SAM 和β-NAD 的反應，即SbzP 先與SAM 結合，釋放第一個產物MTA，同時產生活化的酶復合物（β，γ-不飽和醌），再與第二個底物β-NAD 結合催化得到最終產物。Barra 等［16］捕捉到了沒有β-NAD 存在時SbzP 與ACP 所形成的β，γ-不飽和醌，支持了乒乓機制。通過生物信息學分析發現了更多的sbzP同源基因，這些同源基因存在于不同的生物合成基因簇中，對這些生物合成基因簇進行研究可能會發現更多由β-NAD 衍生而來的天然產物。SbzP 的發現不僅是對ACP 利用酶的重要補充也是對β-NAD 生理學功能的重要補充。

3 ACP 變體轉移酶

生物體除了直接利用SAM 的ACP 基團外，還會以ACP 變體的形式加以利用。這部分主要介紹向底物分子引入氨基丙基修飾的酶，其中亞精胺合酶、精胺合酶等利用脫羧基SAM 作為氨基丙基供體，直接向底物中轉移氨基丙基。而參與微菌素C 生物合成的MccD，則是先利用SAM 向底物引入ACP，底物中ACP 脫羧以后形成氨基丙基修飾。微菌素C 與多胺生物合成中，都涉及到了向底物中引入氨基丙基修飾，但采用了兩種不同的生物合成策略。

3.1 亞精胺、精胺和熱精胺合酶

多胺是一類帶正電荷的小分子脂肪胺，其分子中至少含有兩個氮原子［72］。多胺幾乎存在于所有的生物體中，其種類主要有：腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，SPD）和精胺（spermine，SPM）［73］。多胺在細胞增殖和分化過程中起到重要作用［74］，同時也有助于生物體適應環境脅迫［75］。亞精胺合酶（SPDS）催化脫羧基SAM（dc?SAM）的氨基丙基轉移到腐胺上形成亞精胺同時生成副產物MTA，其中dc?SAM 由SAM 脫羧酶催化SAM 脫羧而生成［11］。精胺合酶（SPMS）繼續催化亞精胺上的氨基丙基轉移反應，從而生成精胺，該反應同樣以dc?SAM 作為氨基丙基供體［76］。在噬熱菌中還存在另外一種亞精胺的生物合成通路，該過程涉及到TAAPT 催化的胍丁胺上的氨基丙基轉移反應，TAAPT 是一類不同于SPDS 和SPMS 的氨基丙基轉移酶［77-78］。精胺是一種對稱的多胺，其結構可以表示為［343］（數字表示氮原子之間的亞甲基的個數），而某些植物和細菌中的熱精胺合酶（TSPS）可以將氨基丙基轉移到亞精胺另一端的氮原子上，生成不對稱多胺——熱精胺［433］［79］。

上述的腐胺、亞精胺、精胺和熱精胺等都是線性的直鏈多胺，此外噬熱菌中還含有支鏈多胺，如N4?二（氨基丙基）亞精胺［3（3）（3）4］和N4?氨基丙基亞精胺［3（3）4］［80］。這兩種支鏈多胺的生物合成過程中，涉及到一種特殊的氨基丙基轉移酶——BpsA［81］。BpsA 能夠催化底物亞精胺上連續兩次的氨基丙基轉移反應，第一次氨基丙基轉移生成N4?氨基丙基亞精胺［3（3）4］，而后進一步以N4?氨基丙基亞精胺作為底物發生第二次氨基丙基轉移，得到最終產物N4?二（氨基丙基）亞精胺（圖7?a）。SPDS、SPMS、TSPS 等氨基丙基轉移酶催化反應的機理都是SN2 取代反應，而BpsA 則是通過乒乓機理催化反應，即BpsA 先與一分子的dcSAM結合，釋放MTA，得到氨基丙基化的酶，修飾后的酶再與底物亞精胺（或N4?氨基丙基亞精胺）結合，釋放產物N4?氨基丙基亞精胺（或N4?二（氨基丙基）亞精胺），同時BpsA 恢復到最初狀態，完成一次催化循環［82］。

圖7 兩種不同的氨基丙基修飾策略Fig. 7 Two different strategies for aminopropyl modification

3.2 參與微菌素C生物合成的MccD

微菌素C（microcin C）是一種由大腸桿菌產生的肽酰核苷酸類抗生素［83］，微菌素C 進入細胞后被氨肽酶水解成天冬氨酰氨基丙基腺苷酸，該物質可以抑制天冬氨酰?tRNA 合成酶的活性，從而影響蛋白質的合成［84］。微菌素C 的化學結構是一個翻譯后修飾的七肽，其中C 端天冬氨酸的α-羧基通過氨基磷酸酯鍵與腺苷相連，在磷酸基團上引入氨基丙基的修飾能夠極大地提高微菌素C 的生物學活性［85］。微菌素C 的生物合成過程如下：首先，核糖體肽MccA 在ATP 依賴酶MccB 的作用下形成氨基磷酸酯鍵與腺苷相連［86］，然后由ACP 轉移酶MccD 催化在磷酸基團上引入ACP，最后由MccE 催化ACP 側鏈脫酸［12］，從而最終形成氨基丙基修飾（圖7?b）。MccD 和MccE 都擁有良好的底物寬泛性，能夠向不同序列，不同長度的肽酰腺苷酸中引入氨基丙基修飾［12］。

4 總結與展望

綜上所述，可以發現不同種類的ACP 利用酶在系統發育關系上距離較遠，例如其中既有PLP 依賴酶也有SAM 自由基酶。還有一些ACP 利用酶與SAM 依賴的甲基轉移酶序列相似性很高，都具有類似的結合SAM 的保守基序，僅是依靠活性口袋結構上的細微差別實現了二者對SAM 中C?S 鍵的選擇性切斷。由于ACP 利用酶之間在序列上的共性較少，且部分ACP 利用酶與甲基轉移酶在序列上的差異并不顯著，導致對ACP 利用酶編碼基因的預測比較困難。深入地認識和理解ACP 轉移酶和甲基轉移酶對SAM 中C?S 鍵選擇性不同的結構基礎，有助于發現更多的ACP 利用酶。如果能夠實現甲基轉移酶到相應的ACP 轉移酶的理性設計，這將是對現有的酶工具的極大豐富。從目前發現的ACP 轉移反應的底物來看，主要集中在以RNA 和小分子為底物，以蛋白質為底物的翻譯后修飾僅有EF2 的白喉酰胺修飾一例。對照SAM 依賴的甲基轉移酶和SAM 自由基酶豐富的底物范圍，我們有理由相信有更多的ACP 相關的蛋白質翻譯后修飾，甚至DNA 修飾的存在。同時，從C?S 鍵斷裂的酶反應機制出發，目前發現的ACP 利用酶中大多以極性機制催化反應轉移ACP。僅有Dph2 一例涉及ACP 自由基的產生。鑒于SAM自由基酶家族5'?dA·實現的多樣的反應類型，我們預測有更多ACP 自由基參與的反應存在。相信隨著對該領域的深入和研究手段的日益豐富，會有更多ACP 利用酶和新穎的酶機制被發現。