RNAi 技術在寄生蜂中的應用研究進展

張龍喜 呂琳 張歡歡 周金成 車午男 董輝

（1. 沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866；2. 西藏自治區農牧科學院蔬菜研究所，拉薩 850032）

RNA 干擾現象最早由Napoli 等［1］于1990 年在矮牽牛（Petunia hyhridaVilm）上發現。Fire 等［2］在研究秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）RNA干擾過程中闡述了基因沉默現象的本質，并將RNA干擾（RNA interference, RNAi）定義為雙鏈RNA（double?strand RNA, dsRNA）降解同源基因mRNA的效應。RNAi 不僅存在于植物和真菌，還廣泛存在于昆蟲中［3-6］。

RNAi 技術現已成為研究生物基因功能主要生物技術方法［7］，并且成功應用于多種昆蟲的基因功能研究中［8］。膜翅目是僅次于鞘翅目和鱗翅目的第三大目，膜翅目中的寄生蜂類群包含12 個科，是膜翅目的重要組成部分，也是防治農林害蟲的重要天敵昆蟲資源［9］。寄生蜂的生長發育依賴于寄主，同時與寄主昆蟲產生相互作用。這些特殊的生物學特性為開展寄生蜂的基因功能研究，尤其是給RNAi 技術等反向遺傳學手段的實施帶來挑戰。

本文綜述了RNAi 技術在膜翅目寄生蜂中的發展與應用，包括RNAi 機制、影響RNAi 效率的因素等。研究將為RNAi 技術在寄生蜂基礎理論和害蟲防治應用的相關研究提供方法參考和科學依據。

1 RNAi 作用機制與dsRNA 遞送方法

1.1 RNAi機制

RNAi 是一種高度保守的細胞機制，目前已知動物中的RNAi 通路有3 種，包括Short/small interfer?ing RNA（siRNA）通路［10-11］、microRNA（miRNA）通路［12-13］和P?element induced wimpy tesis（Piwi）?in?teracting RNAs（PiRNAs）通路［14］。

在昆蟲中，當dsRNA 導入到細胞后，dsRNA 與R2D2 或內源性siRNA 途徑中的Loquacious（Loqs）一起被III 型核糖核酸酶Dicer?2（Dcr2）識別并切割［15］。在這個過程中細胞質中的dsRNA 被切割成19-21 nt 的siRNA 雙鏈，隨后siRNA 被裝載到Ago2 后，Ago2 和其他RNA 誘導沉默復合體（RNA induced silencing complex, RISC） 相關蛋白組裝RISC。RISC 中siRNA 的正義鏈被降解，反義鏈被保留，RISC 通過反義鏈引導RISC 中Ago2 識別并切割互補的靶mRNA［16］。RNAi 主要蛋白質參與者是Agronaute（Ago）家族蛋白，Ago 家族蛋白具有靶RNA 切割活性，AGO 蛋白與小RNA 結合并通過小RNA 和目標mRNA 之間的序列互補，觸發靶RNA的降解［16-18］。siRNA 通路過程見圖1。

圖1 siRNA 介導的RNAi 通路示意圖Fig. 1 Model of siRNA-mediated RNAi pathway

1.2 dsRNA導入方法

目前dsRNA 的導入方法包括顯微注射法、飼喂法、浸泡法、組織培養法、電穿孔、病毒轉染以及轉基因等。寄生蜂主要發育時期都寄生于寄主昆蟲內部，因此不同的dsRNA 導入方法受限于其寄生生活的特性。傳統的飼喂、浸泡等方式導入RNA 的方法可能難以起效。目前，寄生蜂RNA 干擾研究中的導入方法集中于注射，包括卵期注射、幼蟲注射、蛹期注射、成蟲注射以及寄主注射（表1）。

表1 RNAi 在寄生蜂中的應用Table 1 Application of RNAi in parasitoids

1.2.1 顯微注射法 顯微注射法已報道于麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）、中紅側溝繭蜂（Micr?oplitis mediator）、菜蛾盤絨繭蜂（Cotesia vestalis）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus puparum）、斑痣懸繭蜂（Me?teorus pulchricornis）、甲腹繭蜂（Chelonus inanitus）、菜蛾盤絨繭蜂（Cotesia vestalis）、二化螟盤絨繭蜂（Cotesia chilonis）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus pupar?um）、日本開臂反顎繭蜂（Asobara japonica）等寄生蜂的基因功能研究中。

在金小蜂中，對毒液鈣網蛋白（venom calretic?ulin component,v?crc）的敲除效率高達90%［22］；在針對Wolbachia密度抑制基因（Wolbachia density sup?pressor,Wds）的敲除中，沉默效率達到了71%［27］。在中紅側溝繭蜂（M. mediator）中，對Odorant Re?ceptor基因抑制效率超過90%［34］。在菜蛾盤絨繭蜂（C. vestalis） 中， 注射法RNAi 效率可達74%-98%［30］。注射法作用效果快，需要少量的dsRNA 就能對靶標基因進行干擾，但是注射操作對于微型昆蟲來說機械損傷仍然會造成較高的死亡率，同時對于操作環境和技術熟練度要求較高。

1.2.2 浸泡法 浸泡法是將供試昆蟲直接浸泡在dsRNA 溶液中，dsRNA 分子直接通過昆蟲氣孔或表皮滲透至體內，干擾體內靶基因表達。高鵬［35］通過混合dsRNA 和納米材料浸泡處理二化螟盤絨繭蜂（A. chilonis）成蟲，靶基因熱激蛋白基因Cchsp70?4在27℃和36℃下的沉默效率分別達到34.25%和63.36%。然而，何馥晶［36］分別運用納米材料浸泡法與注射法處理二化螟盤絨繭蜂預蛹和蛹發現，兩種方法對靶基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶基因Cccaspase?1的沉默效率無顯著差異。在松毛蟲赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi）中，通過dsRNA 溶液注射寄主卵浸泡處理卵內的子代蜂，靶基因沉默效率達70%［48］。相比于注射法，浸泡更方便更容易操作，對操作技術要求較低；相反，浸泡法所需要的dsRNA 量大，實驗成本較高，且需要dsRNA 穩定的浸泡環境。

1.2.3 飼喂法 飼喂法是將dsRNA 加入昆蟲的食物或人工飼料，昆蟲通過取食進入體內對靶標基因進行干擾的方法。然而，寄生蜂幼期的生長發育依賴于寄主，其幼期脫離寄主將難以存活。在保障寄生蜂正常發育的基礎上對寄生蜂飼喂dsRNA 具有一定難度。目前，應用飼喂法在寄生蜂實施RNAi 的研究鮮有報道。

1.2.4 其他RNAi 方法 細胞轉染法是利用轉染劑直接將dsRNA 遞送到細胞中的干擾方法。Beck等［32］利用細胞轉染法成功抑制中紅側溝繭蜂（M.mediator）glc1.8基因的表達，并挽救High Five 細胞的黏附表型。此外，在昆蟲基因功能的研究中還有轉基因、組織培養法、電穿孔、病毒轉染等方法［32,49-51］。

續表1 Table 1 continued

2 RNAi 在寄生蜂中的應用

寄生蜂是一類營寄生生活的膜翅目昆蟲，寄主大部分為鱗翅目害蟲。寄生蜂寄生行為依賴于對寄主的精準定位以及攜帶的多種寄生因子，包括毒液、多分DNA 病毒（polydnavirus，PDV）、病毒樣顆粒（virus?like particles or MpVLPs）以及化感相關蛋白（OBPs、GRs、CSPs、ORs）等。同時，寄生蜂與宿主昆蟲在生長發育和免疫反應的相互作用分子調控也得到關注。寄生蜂復雜的生物學特性給RNAi 技術的實施帶來諸多挑戰。

2.1 寄生蜂生長發育相關基因RNAi研究

親本RNAi（parental RNAi, pRNAi）可以通過處理生物體的母代，而在后代觀察到基因沉默表型。Olesnicky 等［28］利用pRNAi 原理沉默麗蠅蛹集金小蜂（N. vitripennis）cad基因，研究表明高濃度的dsRNA 使得胚胎停止發育，而低濃度時，雌性產出卵表現出表皮缺陷。基于pRNAi 的研究相對較多，在靶基因方面，tudor和Bicauda1?D、Nv?odd paired等與胚胎形成相關的基因都已相繼在金小蜂中被驗證［24,29］。Geuverink 等［4,19-20,52］利用金小蜂pRNAi，揭示了金小蜂的性別決定級聯方式。

生物體能夠通過生物鐘基因利用光周期協調其發育、繁殖。其中period(per)、cryptochrome?2(cry?2)、clock(clk) 和cycle(cyc) 等生物鐘基因扮演重要角色［53-54］。Mukai 等［23］對金小蜂per基因進行沉默后，金小蜂不能在短時間內產下滯育的卵。相同的是，Dalla 等［26］對金小蜂per基因進行干擾，結果導致晝夜節律時鐘加快，改變了其他生物鐘基因的表達，并推遲了滯育。姜卓［48］通過浸泡法成功將RNAi 技術運用于卵寄生蜂，成功干擾松毛蟲赤眼蜂VgR基因。

2.2 寄生蜂免疫相關基因RNAi研究

2014 年Colinet 等［45］首次報道了寄生蜂毒液蛋白基因的有效沉默，表明LbGAP 是大量存在于布拉迪小環腹癭蜂（Leptopilina boulardi）毒液中的毒力因子。毒液鈣網蛋白是金小蜂基因組里鑒定到的僅有毒液蛋白，毒液鈣網蛋白沉默后，抑制了宿主對金小蜂毒液的先天免疫反應，并減少宿主出血和黑化［22］。與之相反的是，在對日本開臂反顎繭蜂（A.japonica）中2 個已報道的與寄主黑化反應相關的基因進行RNAi 時，結果顯示這2 個基因的RNA 干擾效率均在90%以上，但寄主黑化率、寄生蜂寄生率和出蜂率與對照組相比沒有顯著差異［46］。在中紅側溝繭蜂（M. mediator）中，干擾毒液蛋白基因MmRho1會導致雌蜂卵黃生成素和保幼激素、卵子生成和繭形成的下調。此外，通過酵母雜交實驗表明MmRho1在中紅側溝繭蜂發育和抑制宿主細胞免疫反應中發揮雙重作用［33］。

寄生蜂多分DNA 病毒（PDV）參與調控了宿主寄生蜂的免疫及生長發育過程。在中紅側溝繭蜂（M. mediator）中，MdBV 感染會阻斷High Five 細胞黏附培養板的能力，而通過RNAi 沉默glc1.8的表達可以挽救High Five 細胞黏附［32］。對甲腹繭蜂（C.inanitus）的宿主注射CiV基因的dsRNA 后，挽救了末齡幼蟲的發育停滯，相反，將相同的dsRNA 注射到寄生蜂卵中則阻止了寄生蜂的羽化，降低了寄生蜂的存活率。推測這些病毒基因可能參與誘導寄主發育停滯和軟化角質層［37］。此外，BVs 可能參與核衣殼的形成［30］。

除此之外，病毒樣顆粒也有助于削弱宿主免疫防御系統。在斑痣懸繭蜂（M. pulchricornis）中，MpVLP 在體外培養的早期階段抑制宿主黏附血細胞的附著和擴散，這最終誘導宿主血細胞凋亡，從而保護宿主中產的受精卵［55］。Yokoi 等［40］通過單基因和聯合基因沉默兩種MpVLP 因子，導致對宿主幼蟲漿血細胞的抑制作用減弱，表明兩種MpVLP 因子參與了漿血細胞擴散的抑制，但不參與顆粒細胞的抑制。

2.3 其他基因RNAi研究

近年來，隨著RNAi 技術的成熟，有關寄生蜂RNAi 的基因功能研究逐漸增多。在靶基因上，包括氣味結合蛋白基因（CvesOBP17/18/19）、色素合成相關基因ebony和cinnabar、細胞色素P450基因、熱激蛋白基因（Cchsp70?4）、幼蟲唾液蛋白基因（Pp16911）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cccaspase?1）、α- 淀粉酶基因（PpAmy1、PpAmy2、PpAmy3）、脂肪酸合成酶基因（Fatty Acid Synthases,FASs）、UDP 糖基轉移酶基因（UDP?gly?cosyltransferases,UGTs）等相關的基因功能研究都已報道［21,31,35-36,38-39,41-43,45,47］。

3 RNAi 效率的影響因素

3.1 靶基因的選擇

在已報道的寄生蜂的RNAi 研究中，靶基因或靶序列可分為四類：（1）免疫相關基因，包括毒液蛋白基因［45-46］、病毒樣顆粒［40］、多分DNA 病毒（PDV）［30,32,40］、幼蟲唾液蛋白基因（Pp16911）［42］等。（2）生長發育相關基因，包括DNA 甲基轉移酶基因（Dnmt）［24］、生物鐘基因（per）［23,26］、脂肪酸合成酶基因（FASs）［38］等。（3）生殖及性別決定相關基因，包括與雄性生殖能力和雌性卵子孵化有關的基因，如dsx［19-20］、tra和tra2［4］、VgR［48］等。（4）寄主識別和適應相關基因，包括與嗅覺、味覺、視覺、聽覺和觸覺相關的基因，如氣味結合蛋白OBPs［31］、味覺受體GRs、化學感覺蛋白CSPs、嗅覺受體ORs［44］、熱激蛋白基因（hsp70?4）［35］、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶基因（Cccaspase?1）［36］等。

值得注意的是，使用致死作為表型結果時，應當考慮假陽性結果的風險。可以利用具有特定表型的基因來建立并優化RNAi 技術體系，并作為RNAi效率的指示基因。例如與昆蟲色素沉著相關的基因，包括laccase［56-57］、ebony［47,58］等。

3.2 脫靶效應

與其他昆蟲不同，許多寄生蜂幼期生活于寄主昆蟲體內。dsRNA 的靶向性易受宿主昆蟲影響。于昆蟲的脫靶效應而言，目前已有參數來預測脫靶：與靶基因序列一致性達80%的dsRNA 可有效觸發RNAi；具有完全匹配序列片段≥16 bp 或幾乎完全匹配序列片段>26 bp，其中一個或兩個錯配很少分布的dsRNA（單個錯配插入≥5 bp 的匹配片段之間或插入≥8 bp 匹配片段之間）也能夠觸發RNAi［59］。例如，在對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）篩選防控基因時，dsTcCht10對麗蠅蛹集金小蜂（N.vitripennis）Cht10基因轉錄水平有顯著影響，且赤擬谷盜dsTcCht10與麗蠅蛹集金小蜂同源基因的相似性為66.75%，存在連續19-23 nt 核苷酸的匹配個數［60］。因此為了更好地將RNAi 技術應用于寄生蜂研究，應該加強dsRNA 特異性檢測。

3.3 降解dsRNA的核酸酶

已有的研究表明，昆蟲血淋巴或者中腸中的核酸酶（DNases 和RNases）是降解dsRNA 關鍵因素。在寄生蜂-宿主昆蟲系統中，宿主昆蟲和寄生蜂產生的相關核酸酶均可能對dsRNA 產生降解作用。在昆蟲血淋巴濃度初始劑量相同時，分別以1.0、2.3、11.5、33.0 μg 劑量的幾丁質合成酶同源基因dsRNA 向美洲大蠊（Periplaneta americana）、大麥蟲（Zophobas atratus）、飛蝗（Locusta migratoria）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）注射，分別導致了82%、78%、76%和20%的損耗［61］。進一步研究發現，沉默核酸酶基因可顯著提高RNAi 效率，共同沉默多個核酸酶基因也可顯著提高干擾效率［62］。深入研究表明，不同昆蟲降解dsRNA 的核酸酶所需要的生理條件不同［63-64］。在東亞飛蝗（Locusta migratoria）中，LmdsRNase1可以在最適pH 5 下快速降解dsRNA，而中腸的生理pH 6.8 是LmdsRNase2活性的理想值［65］。綜上所述，昆蟲血淋巴和腸道中的核酸酶對RNAi 效率有嚴重影響，鑒定不同昆蟲降解dsRNA 的關鍵基因，對于研究RNAi 機制具有重要意義。

3.4 dsRNA設計及其他因素

除了上述影響因素外，dsRNA 的長度、結構、反應時間、操作環境、劑量均會影響RNAi 的研究。List 等［66］總結了不同目昆蟲RNAi 研究中所用的dsRNA 分子的有效性：（1）在構建dsRNA 分子大小有效性范圍時，移除死亡率低于67%的結果后，結果顯示有125-628 bp 的有效范圍。在寄生蜂中，dsRNA 分子大小集中在300-600 bp。這些結果與Huvenne 等［67］的結果相近。（2）RNAi 反應持續時間可能對死亡率產生影響。在煙粉虱（Bemisia tabaci）中，飼喂ATP 酶dsRNA 在48 h 時，煙粉虱死亡率達70%。對溫帶臭蟲（Cimex lectularius）連續飼喂28 d 后，死亡率才能達到80%-85%。（3）dsRNA 劑量也是影響RNAi 效果的重要因素。這與dsRNA 的導入方法以及昆蟲的取食方式密切相關。在RNAi 研究中，穩定的操作環境、昆蟲的處理方式以及實驗器材的處理可能也需要考慮。包括注射或飼喂前對實驗器材的滅菌處理，注射過程對成蟲的麻醉方式，注射或飼喂后的培養環境，dsRNA 儲存方式的影響等［68-69］。尤其是在設計靶標基因dsRNA 引物時，也應該考慮昆蟲對dsRNA 堿基偏好性。

4 展望

RNAi 具有高效、特異性強等優點，現階段已成為研究昆蟲基因功能的常規技術。脂質體（liposo?mes）修飾和納米材料包被認為是提升干擾效率的潛在有效方法。但是，由于寄生蜂特殊的生活方式，RNAi 技術在寄生蜂的應用上仍然存在著多種挑戰。在寄生蜂中，傳統的飼喂法RNAi 研究鮮有報道，對于dsRNA 在其體內的遞送機制也尚未揭示。在遞送方式中，飼喂法操作簡便，但目前仍然缺乏大量生產dsRNA 的成本效益高的方法。顯微注射法在寄生蜂RNAi 研究中應用最多，但該方法多數只能在寄生蜂蛹期和成蟲期操作，難以應用于其他發育時期，尤其是寄生蜂的早期胚胎階段。dsRNA 的脫靶和非脫靶效應、作用位點的預測以及潛在的抗性發展問題也是RNAi 技術應用于寄生蜂的重要大挑戰。目前迫切需要建立基于寄生蜂生物學特點的RNAi方法，重點聚焦提高dsRNA 的遞送效率。相關方法的建立將有助于掃清寄生蜂分子調控理論研究和害蟲生物防治應用的技術瓶頸。另外，通過分離昆蟲的腸道共生菌，通過遺傳改造特定共生菌，使其作為在昆蟲體內穩定表達dsRNA 的媒介。以微生物為媒介的RNAi 方法可作為提高寄生蜂RNAi 效率的重要思路。

此外，隨著RNAi 農藥等新型殺蟲劑的研發與應用，相關RNAi 殺蟲劑對寄生蜂等天敵昆蟲的脫靶效應和安全性也值得深入研究。因此，建立寄生蜂類群的RNAi 方法對寄生蜂的分子機理、生理調控、生物防治應用、RNAi 農藥安全性評價等諸多方面均具有重要意義。