單細胞染色質轉座酶可及性高通量測序技術及其應用

趙若含 趙凈穎 柏毅承 張瑞芳 賈俊靜 豆騰飛

（云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201）

真核生物的核DNA 并不是裸露的，而是與組蛋白結合形成核小體，核小體再經逐步的壓縮折疊最終形成染色體高級結構［1］。DNA 的復制轉錄需要將DNA 緊密結構打開，再與轉錄因子或調控因子結合，打開的染色質就叫開放染色質。開放染色質允許其他調控因子結合的特性稱為染色質的可及性［2-3］。2013 年，Buenrostro 等［4］提出一種用于研究染色質可及性的方法，該方法利用高度活躍的Tn5 轉座酶與開放染色質結合，對目標DNA 進行片段化處理和末端修復，并添加測序接頭。隨后對DNA 進行測序，這種方法被稱為染色質轉座酶可及性測序（assay for transposase?accessible chromatin with high?throughput sequencing, ATAC?seq）［5］。但是，ATAC?seq 無法區分樣品中亞群的染色質可及性或亞群之間染色質可及性的差異。在此基礎上，2015 年Cusanovich 等［6］發表了關于單細胞的染色質轉座酶可及性的高通量測序（scATAC?seq），該技術使用Tn5 轉座酶檢測單個細胞中的全部開放區域，將開放的DNA 序列切割下來，再捕獲DNA 序列進行測序，在單細胞層面提供全面的染色質調控圖譜。

scATAC?seq 能在基因組水平上協助了解細胞的轉錄調控過程，揭示不同基因組調控元件和轉錄因子結合位點，從表觀遺傳學的角度來解析基因信息［7］。其中包括開放染色質基因附近的啟動子、增強子以及離啟動子較遠的調控元件如沉默子和絕緣子相關的開放區域。這些開放的染色質元件在基因轉錄調控中扮演著至關重要的角色［8］。尤其真核生物中的細胞類型特異性基因表達受數百萬個順式作用元件和數千個反式作用因子（如轉錄因子）的調節［9］。scATAC?seq 技術可以解釋順式作用元件和反式作用因子之間的網絡，同時還可了解到基因活性和對遺傳變異的可及性。因此，通過研究單細胞染色質可及性信息的技術，了解其原理和應用，明確這些技術在識別轉錄因子結合位點、鑒定基因組調控元件以及研究轉錄調控機制等方面的重要意義。本文綜述了scATAC?seq 技術的發展歷程、7 種技術的優缺點、數據分析和應用，以期為表觀遺傳學研究提供參考。

1 scATAC-seq 技術的發展歷程

scATAC?seq 技術是基于單細胞和ATAC?seq 技術發展起來的，可在單細胞水平上高通量、高分辨率地檢測異質性細胞群的染色質可及性。該技術通過在Tn5 轉座酶結合的接頭序列中添加可區分細胞來源的細胞身份標記序列，實現對捕獲DNA 片段的細胞來源的標記，從而實現高通量的單細胞染色質可及性測序。scATAC?seq 技術為研究單個細胞內的基因表達調控機制提供了新的見解［10］。其中包括多種技術，如組合細胞索引（sci?ATAC）、微流控技術（Fluidigm C1）、超敏位點測序（scTHS）、物理方法（uATAC）、平板技術（Plate）、液滴-微流控技術（dsci?ATAC）和10X 技術［11］。7 種技術的具體信息見表1。10X Genomics 技術與其他技術相比表現出更為簡便和高效的優勢，迅速被廣泛采用并成為scATAC?seq 領域的前沿技術。以下將對scATAC?seq技術的發展歷程、作用機理以及研究進展進行描述。

表1 七種scATAC-seq 技術介紹Table 1 Introduction to seven scATAC-seq technologies

1.1 sci?ATAC及其衍生技術

2015 年，Cusanovich 等［6］提出了單細胞組合索引分析染色質可及性（single cell combinatorial indexing assay for transposase accessible chromatin, sci?ATAC?seq）方法，該方法利用組合索引將細胞核進行分子條形碼標記，無需特殊處理。該技術的流程包括裂解細胞并將細胞核分配到96 孔板中，添加經過定制的、唯一索引的Tn5 轉座酶進行標記，將細胞核稀釋并重新分配到第二個96 孔板中，引入第二個條形碼，最后進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）和測序（圖1?A）。該方法簡單易行，適用于大多數實驗室，但測序覆蓋范圍相對較低，數據質量有待提高。

2018 年，Cusanovich 等［12］在前期方法的基礎上進行了改進，大幅增加了每個細胞獲得的數據量。他們利用這一方法繪制了果蠅胚胎發育過程中染色質調控狀態的動態變化，并鑒定了超過3 萬個具有組織特異性的遠端調控元件。此外，他們使用相同的方法從13 只成年小鼠的17 個樣本中收集了10 萬個細胞進行scATAC?seq，獲得了40 萬個染色質可及性元件的信息，并成功區分了85 個細胞亞群，準確識別了多種組織的大部分細胞類型。這項研究為相關組織的研究提供了重要的參考和借鑒［18］。

1.2 Fluidigm C1

2015 年，Buenrostro 等［13］提出了一種利用物理方法進行細胞分離和scATAC?seq 的技術。該技術基于納米級反應槽，在可編程微流體系統（C1 single?cell auto prep system, Fluidigm C1）中捕獲和評估單個細胞的活力，然后在集成的微流控芯片（integrated fluidics circuit, IFC）上進行細胞裂解和轉座，進而獲得細胞核中的DNA 片段。接下來，通過PCR 擴增、文庫收集和細胞識別條形碼引物的PCR 擴增，將單個細胞文庫匯集，并在高通量測序儀器上進行測序［19］（圖1?B）。盡管該方法依賴儀器，但其數據質量相對于sci?ATAC 而言更好。然而，操作復雜，需要顯微鏡核實每個反應槽的細胞數，且整體獲得的細胞數量相對較少。

1.3 scTHS?seq

2017 年，Lake 等［14］開發了一種名為單細胞轉座子超敏感位點測序（single?cell transposome hyper?sensitive?site sequencing, scTHS?seq）的方法。該方法結合了轉座子超敏位點測序（ransposome hypersensi?tive sites sequencing, THS?seq）［20］的分析技術和使用定制條形碼轉座體的組合細胞索引。scTHS?seq 利用改進后的超級突變型Tn5 轉座酶（Tn5059），具有體外轉錄擴增的線性優勢，并比ATAC?seq 具有更高的靈敏度和細胞特異性的遠端增強子覆蓋度。該方法的步驟包括獲取細胞核并進行計數，在384 孔板上合成帶有獨特條形碼的轉座體復合物，與細胞樣本反應并進行收集，將反應產物轉移到96 孔板上進行反轉錄和擴增，最后進行測序（圖1?C）。scTHS?seq 的優勢在于克服了樣本限制，可處理新鮮或凍存的組織樣本，實現大規模單細胞檢測，并且不受組織細胞解離的影響。

1.4 μATAC?seq

2018 年，Mezger 等［15］開發了一種名為μATAC?seq 的技術，通過納米級液體沉積系統（ICELL8 單細胞系統）對整個細胞中的染色質可及性進行測序。該技術利用物理方法在小體積下實現了scATAC?seq。該方法通過對細胞進行染色并將其加入具有可控溫度和濕度的5 184 個納米孔中，平均每個孔中包含一個細胞。隨后，利用熒光顯微鏡成像識別含有活細胞的孔。然后，在孔中加入帶有條形碼的轉座試劑，并與EDTA 一起進行轉座反應，隨后加入MgCl2，為后續的PCR 擴增做準備。最后進行PCR擴增和構建文庫并進行測序（圖1?D）。該技術將熒光成像和定向試劑沉積應用于大規模平行納米孔陣列中。與Fluidigm C1 技術相比，μATAC?seq 技術的測序量提高了近20 倍，并且降低了每個細胞分析的成本［13］。

1.5 Plate

2018 年，Chen 等［16］開發了一種基于96 孔或384 孔板的scATAC?seq 方法，通過在整個細胞群中預先進行Tn5 標記，提供了一種簡單快速的實驗流程。該方法的步驟包括制備5 000-50 000 個細胞的單細胞懸液，對細胞進行Tn5 標記反應。接著將單個細胞核分選到含有裂解緩沖液（十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K）的板中，等待Tn5 片段釋放。隨后添加吐溫20 以滅活裂解緩沖液中的十二烷基硫酸鈉，然后使用PCR 進行文庫構建和擴增。最后進行匯集、純化和測序（圖1?E）。該方法無需純化和板轉移，具有快速和經濟的優勢。相較于Fluidigm C1和μATAC?seq，無需昂貴的設備。與sci?ATAC 和scTHS?seq 方法相比，該方法不需要定制修改的Tn5轉座酶，進一步簡化了實驗過程。

1.6 dsci?ATAC

2019 年，Lareau 等［17］提出了一種名為基于液滴-微流控技術為基礎的單細胞染色質可及性分析（droplet?based combinatorial indexing for massive?scale single?cell chromatin accessibility, dsci?ATAC）的方法，結合了液滴-微流控技術和ATAC?seq 來進行單細胞染色質開放性分析。該方法利用Tn5 轉座酶對細胞核進行轉座，并將測序接頭整合到開放染色質區域中。通過微流體轉置處理，將轉座的染色質、PCR 試劑和條形碼封裝成單個液滴。細胞識別的DNA 條形碼添加到轉座的染色質中進行擴增，最后進行測序（圖1?F）。該技術成功解決了快速分離細胞的難題，顯著提高了單細胞分析的速度。通過創新的實驗和算法，dsci?ATAC 能夠獲得高達95%的細胞數據。

1.7 10X Genomics

2018 年，10X Genomics 推出了scATAC?seq 技術方法，成為目前最常用的單細胞染色質可及性測序技術［9］。類似于10X Genomics 的scRNA?seq 技術。該實驗流程包括以下步驟：首先制備目標組織樣本的細胞核懸液，然后使用帶有標簽的Tn5 轉座酶切割開放染色質。接下來，利用10X Genomics 的儀器將帶有10X 條形碼的凝膠微珠用于捕獲和標記每個細胞核。在每個液滴中，轉座后的DNA 片段帶有10X 條形碼的標記，而每個條形碼序列代表一個獨特的細胞。最后，完成文庫構建，并使用Illumina高通量測序儀進行測序，以獲取測序數據（圖2）。該方法能夠在短時間內利用微量樣本獲得大量有效信息，具有高靈敏度和較好的試驗重復性。

圖2 scATAC-seq 的技術流程Fig. 2 Technical flow of scATAC-seq（10X）

2 scATAC-seq 的數據分析

scATAC?seq 數據分析通常包括以下步驟：首先進行數據預處理，包括數據質量控制、去除低質量讀長（reads）和PCR 擴增偏差等。常用的軟件工具包括Trimmomatic 和FastQC［21］。接下來，使用比對軟件如Bowtie2 和BWA 將scATAC?seq 的reads 比對到參考基因組上［22］。比對完成后，根據reads 的位置和大小信息生成信號矩陣（count matrix），用于后續的分析。常用的工具包括MACS2 和SAMtools［23］。然后，利用聚類和降維方法，如PCA、t?SNE 和UMAP，對單個細胞進行聚類和降維，以識別不同類型的細胞和細胞狀態［24］。接著，通過計算每個細胞簇中某一基因區域的信號值（如peaks）出現的頻率，進行基因共現分析，以確定不同細胞類型的共同表達基因。常用的軟件包括Cicero［25］和ChromVAR［26］。此外，還可以進行基于已知基因集（如Gene Ontology、KEGG 和Reactome）的基因功能富集分析，以了解不同細胞類型和狀態的基因可能涉及的功能和通路。最后，使用Seurat、Loupe Cell Browser 和scater 等不同的軟件包對分析結果進行可視化。每個實驗的具體分析方法和工具可能因研究目的和數據特點而有所不同，因此在實際應用中可以根據需求進行相應的調整和擴展［18］。

3 scATAC-seq 的應用

3.1 染色體開放性圖譜繪制

細胞的異質性是廣泛存在的生物學現象，不同類型的細胞有序地組合在一起形成特定功能的組織和器官［13］。scATAC?seq 技術通過比較不同細胞類型和細胞亞型在染色體可及性上的差異，從細胞層面揭示更多的表觀遺傳調控信息［27］。在人類基因組染色質可及性圖譜中的繪制，對成人的30 個不同解剖部位鑒定出了30 個細胞大簇和111 個細胞亞簇，并表現出高度組織特異性，并與scRNA?seq 鑒定的細胞類型高度一致［7］。對于大腦研究而言，scATAC?seq 的優勢在于其能夠在高度異質的組織中揭示細胞的染色體可及性，幫助研究不同細胞類型和狀態下的基因調控［28］。在對人類前額葉皮層進行的研究中，使用兩種單細胞測序方法，即單細胞核ATAC?seq（snATAC?seq）和單細胞核轉錄組測序（snRNA?seq），都成功鑒定出了6 種細胞類型，并在整合的UMAP 圖譜中發現細胞類型完全重疊，而且snATAC?seq 測序的細胞核數量約是snRNA?seq 的2倍［29］。這說明scATAC?seq 在細胞核類型鑒定上擁有更高的靈敏性和分辨率。另外，對妊娠中期人類前腦的研究也證實了scATAC?seq 數據具有足夠的靈敏性，可以在高分辨率下區分細胞亞型［30］。而在成年小鼠垂體細胞核的研究中，通過分析染色質開放區域，成功鑒定出11 個細胞簇，包括垂體細胞、催乳素細胞、生長激素細胞等，并發現了染色質可及性的增殖細胞標記物［31］。對于胰腺研究，scATAC?seq 技術針對細胞核進行研究，有望促進整個組織的深入研究，包括胰腺的內分泌腺和外分泌腺細胞類型［32］。總的來說，scATAC?seq 技術在繪制染色體開放性圖譜方面具有單細胞分辨率、全基因組覆蓋、多維數據集成和發現新調控元件等優勢。它為我們深入了解細胞的基因調控和組織的功能提供了有力的工具，尤其在復雜組織如大腦和胰腺中的應用有望取得重要突破。

3.2 疾病潛在標志物的預測

染色質可及性在基因調控和基因組穩定性中具有重要作用。改變染色質可及性模式可能會影響基因組調控區域對關鍵蛋白的可接近性，因此染色質可及性模式已成為人類疾病的重要組成部分［33］。scATAC?seq 可以清晰地發現細胞標志物，并有潛力預測疾病分子標記物。全基因組分析（GWAS）能夠在全基因組水平上檢測遺傳變異并研究基因型與表型的關聯，從而幫助識別與性狀相關的變異［34］。scATAC?seq 可以結合GWAS 的結果，并鑒定與多種復雜性狀和疾病相關的細胞類型特異性富集。例如，自身免疫性疾病在白細胞相對應的細胞簇中顯示出顯著富集，神經學特征如雙相情感障礙、受教育程度和精神分裂癥的富集發生在神經元細胞類型中，而阿爾茨海默病在小膠質細胞中強烈富集［18,30］。此外，通過與基因精細定位、全基因組測序和細胞類型特異性數據的結合，scATAC?seq 具有預測調控功能的變異位點，并檢測目標基因可及性的調控區域。這種方法已在2 型糖尿病、強直性脊柱炎和系統性紅斑狼瘡等疾病研究中得到應用，發現了與疾病相關的轉錄因子、調控元件和靶基因［32,35-36］。此外，snATAC?seq 在晚期阿爾茨海默病的研究中識別了候選的順式調節元件與候選靶基因的聯系，并揭示了固醇調節元件結合轉錄因子1（SREBF1）在疾病中的調控異常［29］。綜上所述，單細胞表觀基因組學在解釋復雜疾病遺傳學方面具有重要意義，能夠識別細胞類型特異性的疾病生物學，并發現易受遺傳風險因子影響的細胞類型，為疾病的理解和治療提供基礎。

3.3 腫瘤發生表觀機制研究

癌癥的發生受到基因和環境之間相互作用的推動。早期組織損傷可能促進癌癥的發展，因此在腫瘤發展到難以控制的階段之前，制定合理的策略來預防、檢測和攔截腫瘤是可能的［37］。癌細胞通過重新調整人類基因組中的調控元件來激活基因，加速腫瘤生長，并產生對治療的耐受性［38］。比如在基底細胞癌中，通過腫瘤微環境的scATAC?seq 有助于表征免疫和基質中的調節網絡以及惡性細胞，并幫助識別與腫瘤浸潤淋巴細胞中T 細胞耗竭相關的調節機制［9］。此外，在結直腸癌中，scATAC?seq 研究發現癌前腺瘤性息肉發展為結直腸癌時，其表觀遺傳和轉錄軌跡非常一致。谷胱甘肽過氧化物酶2（GP?X2）的表達被發現可作為判斷息肉惡性程度的標志，有助于對息肉進行分期和評估風險［39］。此外，對胰腺癌小鼠模型的scATAC?seq 研究表明，在鼠類肉瘤病毒癌（KRAS）基因突變的胰腺上皮細胞中，在組織損傷后48 h 內出現了腺泡到腫瘤的染色質開關。研究發現，這一過程的關鍵靶標是白介素33（IL?33），其細胞因子活性可以替代組織損傷，加速早期腫瘤病變的形成［40］。這些發現為合理設計早期檢測和治療策略提供了新機會，以在早期階段攔截炎癥和關鍵細胞因子驅動的惡性腫瘤。而在肺腺癌中，具有更高侵襲性的腫瘤細胞中發現了與人類晚期肺癌相關的關鍵轉錄因子RUNX 家族轉錄因子2（RUN?X2）。這一發現表明RUNX2 可能作為一個潛在的生物標志物，用于預測患者的預后情況［41］。總體而言，scATAC?seq 技術在癌癥研究中展現出巨大的潛力，通過揭示調控元件、轉錄因子和染色質狀態的變化，有助于深入了解癌癥的發生、發展和治療反應。這為未來開發更有效的預防、檢測和治療策略提供了新的機會。

3.4 轉錄因子的關鍵功能

染色質可及性的改變在細胞分化和發育中扮演著關鍵的驅動角色。scATAC?seq 技術為我們提供了可視化細胞狀態的轉錄程序準備過程的能力，幫助我們深入了解細胞狀態的轉變以及在不同分化狀態下轉錄因子和增強子的變化和可能的決定因素［42］。以視網膜發育為例，研究發現轉錄因子視覺系統同源盒2（Vsx2）對視網膜祖細胞和雙極細胞的發育起著至關重要的作用，其突變會導致小眼癥［43］。同時，在骨骼肌中，通過scATAC?seq 分析發現癌癥中的高甲基化1（Hic1）在骨骼肌間充質祖細胞中充當標志物，其缺失會導致細胞增生［44］。此外，在真皮成纖維細胞中，研究顯示其穩態和損傷時的反應具有顯著的異質性。研究發現，在傷口愈合過程中，維甲酸和RUNX 家族轉錄因子1（RUNX1）是活躍于再生大創面中心細胞上層真皮細胞中的重要轉錄因子［45］。在乳腺上皮細胞的研究中，腔祖細胞可以逐漸轉化為泌乳型祖細胞。在這個分化過程中，轉錄因子的活性會隨著時間的推移而增強或減弱，其中包括SMAD 家族成員2（SMAD2）和GATA 結合蛋白1（GATA1）［46］。Smad 家族蛋白主要參與調控轉化生長因子信號，而GATA 則在成熟腔細胞分化過程中發揮重要的調節作用。這些發現表明不同的轉錄因子在細胞分化過程的不同階段具有關鍵的功能。在免疫反應研究方面，通過對LPS 刺激奶牛全血前后進行scATAC?seq 分析，研究人員除了確認已知的多效性轉錄因子核因子κB（NF-κB）外，還發現了關鍵轉錄因子NFKB1、NFKBIZ、IRF5、IRF7、IRF9 和STAT1 等，它們參與調控免疫反應和促炎反應的過程［47］。此外，雞胚胎體軸發育的時空序列研究表明，內源性順式調控元件的表觀基因組沉默會破壞轉錄因子15（TCF15）和間充質同源框1（MEOX1）的表達，導致體軸伸展異常的出現［48］。最后，在牛和豬的骨骼肌研究中，scATAC?seq 技術鑒定了E2F7、JUND、ZBTB18、HLF、BACH2、FOSL2 和MAFA 等轉錄因子在肌肉發生過程中的潛在功能［49］。豬骨骼肌的研究強調了早期生長反應因子1（EGR1）和ras 同系物家族成員B（RHOB）轉錄因子在胚胎骨骼肌發育中的關鍵性作用［50］。綜上所述，scATAC?seq 技術在不同類型細胞分化和發育研究中提供了寶貴的信息，幫助我們深入了解細胞狀態轉變的調控機制以及關鍵轉錄因子和增強子的變化，為癌癥、發育生物學和免疫學等領域的研究提供了新的視角和有益線索。

4 展望

scATAC?seq 是一種重要的單細胞測序技術，可揭示不同類型細胞之間的異質性問題，并對開放染色質的可及性進行表征，從而深入研究染色質、轉錄因子和調控元件之間的動態變化和相互作用關系。該技術在細胞生物學和基因組學研究中應用廣泛。它能夠鑒定不同細胞類型、分析轉錄因子功能、識別和注釋增強子區域，并揭示細胞發育和分化過程中的動態變化。此外，scATAC?seq 還可應用于疾病研究，發現疾病相關的染色質特征和轉錄因子變化，從而深入了解疾病的發生機制。該技術還有助于藥物篩選和治療優化，通過評估藥物對細胞的影響，幫助優化藥物治療策略。盡管scATAC?seq 是一項強大的技術，但仍存在改進的空間。需要解決的問題包括提高數據質量和降低噪音水平，改善細胞捕獲效率以提高數據可靠性和廣泛適用性。此外，開發更準確、高效的數據分析方法是必要的，以解析復雜的染色質可及性數據并實現準確的細胞類型鑒定、轉錄因子分析和增強子注釋。另外，整合和比較多個數據集的工具和方法需要進一步改進，以提供更全面的認識細胞類型和轉錄調控的多樣性。最后，降低成本和提高效率也是需要關注的方面，以促進scATAC?seq 在大規模研究中的廣泛應用。綜上所述，隨著技術的不斷成熟，scATAC?seq 正成為生物醫學領域中不可或缺的重要工具。