黃瓜內果皮汁液對種子萌發的影響

楊艷 莫雨杏 周祎 陳惠明 肖浪濤 王若仲

（1. 湖南農業大學生物科學技術學院植物激素與生長發育湖南省重點實驗室，長沙 410128；2. 嶺南師范學院生命科學與技術學院，湛江524048；3. 湖南省農業科學院蔬菜研究所，長沙 410125）

黃瓜（Cucumis sativusL.）為葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，生長周期短，一年兩種。我國主要以種植華南型黃瓜為主，但華南型黃瓜果實在高溫高濕環境下易發生胎萌（vivipary, VP），即種子在果實內易萌發，胎萌的種子可嚴重影響制種產量和品質［1-3］，給農業生產帶來重大損失。胎萌黃瓜果實內部汁液含量很少，未胎萌的存在大量汁液，生產上收瓜時常用其汁液浸泡種子防止萌發，但其抑制機制尚不清楚。因此，研究黃瓜內果皮汁液影響種子萌發并探明其影響機制，對基于黃瓜來源的種子萌發抑制劑研發具有重要意義。

胚外部因素可影響種子氣體交換、水分吸收、胚中化學成分釋放和化學成分代謝等過程，進而影響萌發［4-5］。種子外部的種皮和果皮可影響種子吸水、呼吸等過程［6-7］；滇重樓（Paris polyphylla Smithvar. yunnanensis（Franch.）Hand.?Mazz.）種皮可抑制種子萌發［8］；黃花蒿（Artemisia annuaL.）葉對狗尾巴草（Setaria viridis（L.）Beauv.）種子萌發具有明顯抑制作用［9］。除了這些固體因素可影響種子萌發，植物自身液體也可影響種子萌發。例如，銀杏（Ginkgo bilobaL.）外種皮汁液高濃度時可降低可溶性糖和可溶性蛋白含量，進而抑制小麥（Triticum aestivumL.）種子萌發［10］；西洋參（Panax quinquefoliusL.）果汁可有效抑制種子萌發［11］；20-30 g/L 香蔥（Allium cepiformeG. Don）水浸提液可促進草莓種子萌發［12］；少花龍葵（Solanum americanumMill.）果汁原液抑制小白菜（Brassica campestrisL. ssp.chinensisMakino var.communisTsen et Lee）種子萌發，稀釋20-50 倍后其抑制作用才解除［13］；西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai）汁可抑制其瓜籽萌發［14］。番茄（Solanum lycopersicumL.）、石榴（Punica granatumL.）、芒果（Mangifera indicaL.）、楊桃（Averrhoa carambolaL.）、檸檬（Citrus×limon（Linnaeus）Osbeck）、葡萄（Vitis viniferaL.）等汁液濃度高于8%時，番茄種子萌發率降低，當濃度低于8%時，這些汁液均能顯著提高番茄種子的萌發率；而蘋果（Malus pumilaMill.）和李子（Prunus salicinaLindl.）果汁濃度高于8%則能很好地促進番茄種子萌發［15］。顯然，這些胚外部位存在影響種子萌發的化學成分。此外，植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellins，GAs）在調控種子萌發過程中發揮著重要作用［16-17］。在植物果皮、種皮、葉和汁液等部位均存在植物激素ABA 和GAs。研究表明，ABA 具有抑制種子萌發的作用［18］，ABA 合成基因NCED1和NCED2和信號轉導基因CsPYL2、CsPP2C2和CsSnRK2以及代謝基因CsCYP707As等均與種子萌發相關［19-20］。經研究證實，黃瓜葉片水浸提液對其種子萌發具有抑制作用，且浸提液濃度越高抑制作用越明顯［21］。

黃瓜內果皮汁液在種子萌發方面的功效及機制鮮有報道，且大部分研究在胚外因素影響種子萌發方面主要簡單分析一些發芽速度、整齊度等指標，較少涉及與ABA 相關基因方面的復雜分析。

本研究以難胎萌黃瓜（M?H）內果皮汁液處理易胎萌黃瓜（C?L）種子，測定和分析種子萌發過程中相關生理生化指標的變化，探究汁液對黃瓜種子萌發的影響及其機制，同時為基于黃瓜來源的種子萌發抑制劑研發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

難胎萌（M?H）和易胎萌（C?L）黃瓜品種由湖南省蔬菜研究所陳惠明研究員提供，2021 年種植于湖南農業大學植物激素與生長發育湖南省重點實驗室智能大棚。

取樣方法：分別采摘授粉后第40 和50 天黃瓜果實各5 個，縱向剖開果實后分別收集內果皮汁液、種子各3 份，重復3 次取樣；汁液經液氮處理后?80℃保存備用，鮮種子去掉外部黏液質后進行萌發試驗，剩余種子風干后?4℃儲存備用。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發試驗

1.2.1.1 汁液對種子萌發的影響 取175 g M?H 汁液4 000 r/min 離心5 min，其中50 g 上清液加蒸餾水稀釋成質量分數為50%的培養液，剩余的100 g 上清液直接培養C?L 種子。種子萌發率統計時間分別為20 和25 h，每個處理5 次重復，每個重復50 粒種子，均置于30℃恒溫培養箱中。

式中，S：供試種子總數；N：萌發種子總數。

1.2.1.2 汁液提取液對種子萌發的影響 20 g 質量分數為100%的上清液經95%乙醇提取3 次，乙醇相浸膏再依次通過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次后，分別得到石油醚相浸膏1.81 g、乙酸乙酯相浸膏1.49 g、正丁醇相浸膏2.15 g，余下水相浸膏10 g，最后各浸膏加蒸餾水稀釋成質量分數為3%的培養液。各培養液分別處理C?L 種子。種子萌發率統計時間分別為16、21 和26 h，每個處理3 次重復，每個重復30 粒種子，均置于30℃恒溫培養箱中。

1.2.2 汁液化學成分分析 分別稱取C?L、M?H 黏液質和汁液55 mg，黏液質經液氮研磨并冷凍干燥成白色粉末，2 個樣品分別加入5 mL 甲醇于20℃超聲提取30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液真空濃縮干燥，100% HPLC 甲醇復溶，過0.22 μm 有機膜并于4℃保存備用。使用安捷倫6550 四極桿飛行時間質譜儀對其進行化學成分分析。進樣條件：正離子模式，進樣量2 μL，流動相：A（0.1% Fa?H2O）、B（acetonitrile），流速：0.3 mL/min，進樣時間35min，分析條件見表1。

1.2.3 可溶性糖含量的測定 選取20 mg 新鮮種子磨碎，加入5 mL 蒸餾水并水浴60 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣經熱水洗滌數次，離心合并上清液并定容至刻度線，取100 μL 樣品提取液，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量［22］。

1.2.4 植物激素ABA 和GA 含量測定 采用植物激素與生長發育湖南省重點實驗室建立的高效液相色譜法（HPLC 法）測定ABA 和GA 含量。取保存于?80℃質量分數為100%汁液和蒸餾水處理的種子加入液氮迅速研磨至粉末狀，編號，分別稱取粉末狀樣品200 和100 mg，重復3 次；80%甲醇4℃超聲，混勻后置于4℃浸提12 h，重復浸提一次并合并上清液，真空濃縮干燥后備用，根據內標法定量。

1.2.5 基因表達分析 選取質量分數為100%汁液和蒸餾水處理的種子對ABA 合成基因、信號轉導基因、代謝基因等生化指標進行分析。在NCBI 數據庫中下載黃瓜ABA 合成基因CsNCED1（LOC1012?14535）和CsNCED2（LOC101219505）、信號轉導基因CsPYL2（LOC101214314）、CsPP2C2，參考玉米和擬南芥基因CYP707A1、SnRK2并運用DNAMAN的序列比對功能，在黃瓜中分析克隆到與玉米或擬南芥高度同源的基因片段序列，利用Primer 5.0 設計長度在18-22 bp 的qPCR 擴增引物（表2）。

表2 相關基因及qPCR 引物Table 2 Related genes and qPCR primers

取質量分數為100%汁液和蒸餾水處理5、10、15、20 和25 h 后的種子，利用RNA 提取試劑盒（Trans ZolTM Up Plus RNA Kit）提取其總RNA。RNA 濃度經多功能酶標儀（Tecan?Spark）檢測后，使用反轉錄試劑盒（全式金公司）反轉錄合成cDNA，以黃瓜Actin為內參基因（AB010922.1），以合成的cDNA 為模板，利用qPCR（BIO?RAD T100TMT hermal cycler） 檢測基因CsNCED1、CsNCED2、CsYP707A1、CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2的表達情況。反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45 個循環。采用2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對表達量。每個基因的表達反應重復3次。反應體系如表3所示。

表3 反應體系Table 3 Reaction system

1.2.6 數據統計與分析 采用Origin 和Excel 2010軟件進行作圖和制表。

2 結果

2.1 黃瓜胎萌性狀觀察

分別從授粉后不同時期的C?L、M?H 植株上摘取新鮮黃瓜，縱向剖開后觀察其內部種子萌發情況。C?L 黃瓜果實授粉35 d 后胎萌情況輕，將瓜內未萌發的種子取出后，置于無水狀態下12 h 后大量萌發（圖1?F）；C?L 黃瓜果實授粉50 d 后胎萌情況嚴重，內果皮汁液大量減少，瓜內種子已全部萌發，部分高達5.80 cm 長的綠色幼苗突破外果皮（圖1?A-B和圖1?E）。M?H 果實種子未出現胎萌現象，在授粉50 d后其內部仍存在大量汁液（圖1?C-D）。由此可見，難胎萌的M?H 果實內部汁液可能存在抑制種子萌發的化學成分，因此后續將其汁液作為處理用的材料。

圖1 黃瓜果實胎萌表型Fig. 1 Viviparous phenotypes of cucumber fruits

2.2 汁液對黃瓜種子萌發的影響

為探究M?H 汁液是否抑制C?L 種子萌發，分別選取不同質量分數的M?H 汁液處理C?L 種子。質量分數為50%汁液在20 h 對種子的抑制率為73%，比對照高23%；質量分數為100%的汁液完全抑制種子萌發，抑制率一直為100%；同時種子胚根長度隨著汁液質量分數變高而變短（圖2 和圖3）。

圖2 汁液處理的黃瓜種子萌發表型Fig. 2 Germination phenotypes of cucumber seeds treated with juice

圖3 汁液處理的黃瓜種子萌發率Fig. 3 Germination rate of cucumber seeds treated with juice

2.3 汁液提取液對黃瓜種子萌發的影響

為進一步確證汁液中是否存在抑制種子萌發的化學成分，使用質量分數均為3%汁液提取液處理C?L 種子（圖4 和圖5），乙醇相、正丁醇相化學成分在種子整個萌發過程中均呈現抑制作用。乙醇相16、21 和26 h 抑制率分別比對照高3.34%、11.11%和12.22%；乙醇相16、21 和26 h 抑制率分別比乙酸乙酯相高17.78%、14.44% 和11.11%。正丁醇相16、21 和26 h 抑制率分別比對照高47.23%、46.67%和47.77%；正丁醇相16、21 和26 h 抑制率分別比乙酸乙酯相高61.67%、50%和46.33%。乙酸乙酯相化學成分在種子萌發16 h 呈現促進作用，萌發率比對照高14.44%，21 和26 h 萌發率與對照差異不明顯。石油醚相和水相在整個萌發過程中對種子萌發影響較小?？梢姡S瓜內果皮汁液中存在抑種子萌發的化學成分。

圖4 汁液提取液處理的黃瓜種子萌發表型Fig. 4 Germination phenotypes of cucumber seeds treated with the extracts of juice

圖5 汁液提取液處理的黃瓜種子萌發率Fig. 5 Germination rates of cucumber seeds treated with the extracts of juice

2.4 汁液化學成分分析

汁液經UPLC?Q?TOF?MS 分析后共得到32 個化合物（圖6 和表4），主要為有機酸、氨基酸、醇類、醛類、酮類和醚類等，其中棕櫚酸、肉豆蔻酸、檸檬酸、組氨酸等均可影響種子萌發。

圖6 汁液提取液LC-Q-TOF-MS 檢測的正離子模式總離子流圖Fig. 6 Total ion chromatogram of positive ion mode detected by LC-Q-TOF-MS of juice extract

表4 汁液化學成分Table 4 Compounds of juice

2.5 汁液處理下黃瓜種子生理指標的變化

2.5.1 可溶性糖含量的變化 質量分數為100%汁液處理的干種子吸脹至10 h 可溶性糖含量下降至4.21%，比對照（蒸餾水）減少0.43%；萌發15-25 h，其可溶性糖含量比對照高但變化不大。對照種子可溶性糖含量變化明顯，種子吸脹至5 h 其可溶性糖含量減少至4.28%，10 h 較15 h 增加0.29%，15 h較10 h 減少0.87%，20 h 較15 h 增加0.1%，25 h 較20 h 減少0.29%（圖7）。可見，汁液處理的種子在萌發過程中可溶性糖代謝不活躍。

圖7 黃瓜種子萌發過程中可溶性糖含量變化Fig. 7 Changes of soluble sugar contents in cucumber seeds during germination

2.5.2 ABA 和GA3含量的變化 種子萌發后2 個處理的ABA 含量均減少，但質量分數為100%汁液處理的種子萌發5-25 h ABA 含量均比對照（蒸餾水）高，其含量分別增加了96.39%、22.67%、73.49%、94.85%和13.59%（圖8?A）。汁液處理的種子在吸脹0-10 h，GA3含量分別比對照低12.83%和22.23%，15-25 h 時，其GA3含量分別比對照高32.27%和43.57%（圖8?B）。通過比較ABA 和GA3的含量（圖8?C），結果表明，汁液處理的種子0-20 h ABA/GA3均顯著高于對照，分別為125%、58.21%、73.14%和47.12%。說明質量分數為100%汁液處理的種子未萌發可能是由較高的ABA/GA3造成的。

圖8 黃瓜種子萌發過程中ABA 和GA3 的含量Fig. 8 ABA and GA3 contents in cucumber seeds during germination

2.6 汁液處理下黃瓜種子ABA相關基因的變化

2.6.1 ABA 合成基因表達量的變化 質量分數100%汁液處理的黃瓜種子ABA 含量較高，但是否與其合成酶基因CsNCED1和CsNCED2存在聯系尚不清楚。種子萌發過程中CsNCED1和CsNCED2表達量總體呈下降趨勢，但在汁液和對照（蒸餾水）中存在差異。汁液處理的種子在10 和15 hCsNCED1表達量分別比對照顯著增加1.19 倍和2.65 倍（圖9?A）。汁液和對照處理的種子CsNCED2在吸脹0-5 h 表達量均減少且降到最低；5-10 h 兩個處理的CsNCED2表達量增加；15-25 h 汁液處理的CsNCED2表達量分別比對照顯著增加5.28、2.11 和4.35 倍（圖9?B）。可見，汁液處理的種子ABA 含量上升與CsNCED1和CsNCED2表達量增加有關。

圖9 黃瓜種子萌發過程中ABA 合成基因的相對表達量Fig. 9 Relative expressions of ABA synthesis genes during cucumber seed germination

2.6.2 ABA 代謝及信號轉導途徑基因表達量的變化 為探究汁液如何調節ABA 代謝進而影響黃瓜種子萌發，進一步分析比較了在萌發過程中，汁液處理和對照（蒸餾水）處理的種子ABA 信號轉導及代謝途徑基因的表達差異。結果顯示，汁液處理的種子ABA 信號轉導基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2和代謝基因CsYP707A1的表達量均呈先上升后下降的趨勢，且均在20 h 表達量最高。種子萌發5 h 和15-25 h 時，CsYP707A1表達量分別比對照顯著增加9.42、0.77、4.91 和2.70 倍，10 h 時較對照降低63.73%（圖10?A）；5-25 h 時，汁液處理的CsPYL2表達量分別比對照顯著增加0.79、2.68、4.78、15.98和3.86 倍（圖10?B）；10-25 h 時CsPP2C2表達量分別比對照顯著增加1.11、0.61、3.58 和1.71 倍（圖10?C）；10-25 h 時CsSnRK2表達量分別比對照顯著增加2.09、3.33、11.47 和4.02 倍（圖10?D）。結果表明，汁液可誘導ABA 代謝及信號轉導途徑基因表達上調。

圖10 黃瓜種子萌發過程中ABA 代謝及信號轉導途徑基因相對表達量Fig. 10 Relative expressions of ABA metabolism and signaling pathway genes during cucumber seed germination

3 討論

3.1 汁液處理下黃瓜種子萌發的生理差異分析

C?L 種子通過M?H 汁液處理后，其萌發率均較對照低，且抑制作用隨著質量分數升高而變強，這和肉桂酸抑制‘定豌10 號’種子萌發且抑制作用隨著其濃度上升而變強的結果一致［23］，也證明黃瓜內果皮汁液可有效抑制黃瓜種子萌發?？扇苄蕴菫榉N子萌發提供主要能量，其變化趨勢可反映種子在生長發育過程中的活性情況［24］。當汁液質量分數為100%時，其處理的種子萌發率一直維持為零，可溶性糖含量在吸脹0-10 h 時均比對照低，后期變化較小，對照種子在整個萌發過程中可溶性糖含量變化較大，原因是種子吸脹前8 h 為快速吸水期，此時可溶性糖的轉化已被啟動，蔗糖需要轉化為葡萄糖、果糖等單糖為萌發提供能量［25］，而汁液處理的種子在同時期并未出現相同的趨勢。此外，汁液經不同化學試劑提取后，乙醇相、正丁醇相在種子整個萌發過程中都呈現抑制作用，尤其正丁醇相抑制作用最強，這和Barh 等［15］研究結果一致。由此可見，汁液中的一些化學成分可能阻礙可溶性糖發生轉化，使種子不能利用正常形式的單糖提供能量，從而不能順利萌發。

3.2 汁液化學成分影響種子萌發

化感物質是指植物自身產生并且能夠影響周圍其他植物生長發育過程的一類化學成分，其主要應用于雜草防治和種子萌發方面?；形镔|因化感作用所產生，主要為次生代謝物，汁液中存在的肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸均為典型的化感物質［26］，它們均對種子萌發具有抑制作用［27-28］。此外，隸屬氨基酸的組氨酸也可影響種子萌發，番茄種子在較低濃度組氨酸處理下可提高種子萌發率［29］。當然，汁液中還存在一些其他有機酸類，例如己酸、己二酸等，它們在種子萌發方面的功效尚待探究。種子經汁液處理后萌發率顯著降低，這可能與肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸等化學成分有關。

3.3 汁液處理下植物激素ABA相關基因表達分析

種子萌發過程中ABA 含量增加與其合成、信號轉導及分解代謝途徑基因有著密切的關系。汁液處理的黃瓜種子ABA 含量比對照高且呈先下降后上升再下降的趨勢，這和王慰親［30］、胡琦娟［31］和Frey 等［32］研究結果一致。NCED1和NCED2是控制ABA 生物合成的關鍵基因，這兩個基因的表達量在種子萌發過程中出現上升趨勢，證明黃瓜種子中ABA 含量增加與這兩個基因表達上調有關。ABA信號轉導途徑基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達量增加，這和干旱條件下黃瓜幼苗ABA 信號轉導途徑基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達上調和ABA 大量增加的結果一致［33］，這說明ABA 含量增加與這3 個信號轉導基因表達量增加有關。此外，汁液處理后ABA 代謝基因CsCYP707A1表達量增加，這與CsCYP707A1、AtCYP707A2在種子萌發過程中被外源ABA 誘導促使其表達上調［20,34］和擬南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）種子吸脹24 h 后CYP707A1表達量增加［35］的研究結果相似。CYP707A2主要負責種子休眠釋放和萌發過程中ABA 降解，雖然CYP707A1也參與種子中ABA 的分解代謝，然而它在打破休眠中的作用很?。?6］?；谶@些研究，本文表明汁液處理的種子CsCYP707A1表達量雖高，但其編碼的酶不足以分解汁液誘導增加的ABA，因此種子并未萌發。此外，ABA 合成基因CsNCED2與代謝基因CsCYP707A1和信號轉導基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2有著一致的表達趨勢，說明CsNCED2與這4個基因關系密切。大麥（Hordeum vulgareL.）HvNCED2在ABA 生物合成和防止采前發芽方面比HvNCED1發揮更重要的作用［36］，本研究所用材料為易胎萌黃瓜品種種子，CsNCED2可能與HvNCED2發揮相似的作用。由此可見，高濃度汁液處理種子可上調ABA 合成、代謝及信號轉導途徑基因的表達，進而促進ABA 合成和抑制種子萌發。

4 結論

難胎萌黃瓜（M?H）內果皮汁液及其乙醇和正丁醇提取液均抑制易胎萌黃瓜（C?L）種子萌發。在M?H 內果皮汁液中鑒定到4 種影響種子萌發的化學成分：肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸和組氨酸，它們可能促使ABA 合成基因CsNCED2及信號轉導基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達量增加，進而提高ABA 含量，同時阻礙可溶性糖代謝，從而有效降低C?L 種子萌發率。