香蕉MaMC6 的克隆及原核表達分析

滕夢鑫 徐亞 何靜 汪奇 喬飛 李敬陽 李新國

（1. 熱帶作物生物育種全國重點實驗室 海南大學熱帶農林學院，?？?70228；2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，?？?71101）

程序性細胞死亡（programmed cell death, PCD）在植物的生長發育中發揮著重要的作用，是植物抵抗生物和非生物脅迫的基本機制［1-2］。多項研究表明，動物和植物細胞［Ca2+］cyt的升高是誘導PCD發生的必要條件。Ca2+可通過增加細胞內鈣水平導致液泡破裂［3］；直接激活鈣依賴的核酸內切酶，使DNA 發生降解［4-5］；影響線粒體通透性轉變，促進線粒體釋放出細胞色素c，激活下游類caspase 3 等方式參與PCD［6］。

Metacaspases（MCs）屬于半胱氨酸蛋白酶類［7］，在植物PCD 過程中起著關鍵的調控作用。根據空間結構域和氨基酸序列的相似性，植物 MCs 分為兩個亞類：I 型MCs 的N 端前結構域包含富含脯氨酸的重復基序，并且在植物成員中還有一個鋅指基序。II 型MCs 不含有這樣的前結構域［8-9］。但MCs 缺乏caspases 活性，并且不負責在植物細胞死亡期間檢測到的類caspase 活性［10］，另有研究表明MCs 的表達可能導致下游具有類caspase 活性的蛋白酶激活［11］，啟動PCD 的發生。MCs 在擬南芥中研究較多，AtMC1、AtMC2、AtMC8和AtMC9等可正向或反向調控PCD 的發生［12-14］，且多個成員受生物和非生物脅迫誘導表達［15-17］。水稻OsMCs家族成員在響應非生物和生物脅迫下也有不同的表達模式，其中OsMC1和OsMC7受鹽脅迫誘導上調表達［18-19］。

香蕉產業已成為熱帶高效農業的支柱，海南省因自然資源條件適宜，是中國香蕉主產區之一［20-21］。香蕉對環境的變化極其敏感［22］，由于生產上施肥不當和海水倒灌導致的土壤鹽堿化，以及發展海水灌溉農業的需要［23］，使得對香蕉耐鹽的研究變得十分重要。在前期研究中我們發現，不同苗齡和組織部位對脅迫的響應存在特異性［24-25］，而懸浮細胞同質性高［26］，可以對外部刺激做出快速而一致的反應，是一個對研究有價值的簡單和可控的系統，因此被廣泛用于大麥（Hordeum vulgareL.）、小麥（Triticum aestivumL.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和柑橘（Citrus reticulataBlanco）等植物對脅迫響應的生理和分子機制研究［27-30］。

前期研究中我們發現MaMC6可對鹽脅迫做出快速的響應［31］，但該基因的表達在鹽脅迫下是否起著積極的調控作用有待進一步研究。本實驗從巴西蕉（MusaAAA Cavendish cv. Brazil）細胞中克隆到MaMC6基因，然后利用生物信息學和分子生物學等手段對其進行鑒定及分析。檢測鹽脅迫以及不同鈣效應劑對MaMC6表達量的影響，轉大腸桿菌驗證基因功能，為豐富香蕉耐鹽機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所保存的巴西蕉懸浮細胞系，繼代周期為7 d，培養條件為：溫度26℃，光照時間16 h/d，轉速150 r/min。

鹽脅迫及鈣效應劑處理：分別用100 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl2、100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L EGTA 和100 mmol/L NaCl +5 mmol/L LaCl3處理繼代后第5 天的巴西蕉細胞，并在處理后的0、2、4、8、16、24 h 進行取樣。取1.8 mL 懸浮細胞于2 mL 離心管中，25℃、8 000×g離心6 min，去除培養基，液氮速凍，置于?80℃保存備用。每組處理取3 次重復。

煙草材料為30 d 苗齡的野生型本氏煙（Nicoti?ana benthamianaL.）。

1.2 方法

1.2.1MaMC6基因的克隆 根據MaMC6的CDS序列，設計帶有NcoI? 和SpeI?酶切位點的引物1302?MaMC6?F/R（表1），以巴西蕉細胞cDNA 為模板，用PrimeSTAR Max DNA 聚合酶擴增亞細胞定位所需的特異性目的片段，將MaMC6連接到pCAMBIA1302?GFP 載體上；用帶有NcoI? 和XhoI?酶切位點的引物pET28a?MaMC6?F/R 擴增構建原核表達載體所需的特異性目的片段，將MaMC6連接到pET28a 載體上。連接后的質粒轉化大腸桿菌感受態DH5α，隨機挑取單克隆進行培養，菌液PCR 驗證，陽性單克隆菌液送至上海生工公司測序鑒定。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.2 生物信息學分析 從香蕉基因組數據庫（https://banana?genome?hub.southgreen.fr/） 中 檢 索獲得MaMC6 堿基序列、蛋白序列和上游2 000 bp啟動子序列；使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白理化性質進行預測；使用TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM?2.0）進行蛋白跨膜結構預測；利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索MaMC6 的氨基酸同源序列，然后使用DNAMAN 進行多序列比對，MEGA?X 構建系統進化樹；通過PredictProtein（https://predictprotein.org/）進行蛋白二級結構預測，SWISS?MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白三級結構預測；通過PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測，并使用TBtools 對其進行可視化。

1.2.3MaMC6的表達分析 使用TIANGEN 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，提取巴西蕉細胞總RNA。諾唯贊反轉錄試劑盒說明書，將總RNA 反轉錄為cDNA，反轉錄產物在?20℃下保存備用。實時熒光定量PCR（RT?qPCR），使用 QuantStudio 6 Flex實時熒光定量 PCR 儀，以香蕉A 基因組Actin為內參基因，用目標引物進行PCR 擴增（表1），對目的基因進行特異性表達分析。反應體系（10 μL），反應程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，共40 個循環，反應結束后將結果導入Excel 軟件，采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量［25］。

1.2.4 亞細胞定位觀察 采用在煙草葉片中瞬時過量表達的方法，觀察MaMC6 在細胞內定位情況。從測序正確的單克隆中提取pCAMBIA1302?MaMC6?GFP 質粒，轉化農桿菌感受態LBA4404。以轉入pCAMBIA1302?GFP 質粒的LBA4404 為對照，注射煙草葉片下表皮，黑暗培養1 d，光照培養2 d 后，制片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5MaMC6 的誘導表達及在大腸桿菌BL21 中的抗性分析 從測序正確的單克隆中提取pET28a?MaMC6質粒，轉化大腸桿菌感受態BL21。分別將含有重組質粒pET28a?MaMC6和空載質粒pET28a的大腸桿菌BL21 使用IPTG 誘導表達，再將誘導后的菌液按梯度稀釋為1、10-1、10-2、10-3、10-4的濃度。稀釋后的菌液各取4 μL 滴在含有800 mmol/L NaCl 和800 mmol/L 甘露醇的LB 固體培養基上培養，置于37℃培養進行鹽脅迫和滲透脅迫試驗，另一組置于50℃培養進行高溫脅迫試驗，以正常培養為對照組，12 h 后觀察重組菌和對照菌生長存活情況并拍照。

2 結果

2.1 MaMC6的克隆

MaMC6由963 個堿基組成，凝膠電泳結果如下圖1 所示。擴增出接近1 000 bp 的特異性條帶，與預期大小相近。

圖1 MaMC6 凝膠電泳圖Fig. 1 MaMC6 gel electrophoresis image

2.2 MaMC6生物信息學分析

MaMC6 由320 個氨基酸組成，分子質量約為34.21 kD，等電點為5.99，不穩定系數為35.43 屬于穩定蛋白，脂肪系數為85.97，親水平均系數為?0.051屬于親水蛋白，不含有跨膜結構。

序列多重比較結果顯示MaMC6 與其他幾種植物氨基酸序列有較高的相似性，保守結構域與擬南芥metacaspase?9 一致含有一個caspase?like domain，同屬于II 型metacaspase（圖2）。

圖2 MaMC6 與其他植物氨基酸序列多重對比Fig. 2 Multiple comparison of amino acid sequences between MaMC6 and other plants

對包含MaMC6 在內的20 個同源氨基酸序列進行對比，使用MEGA?X 構建系統進化樹。圖3 所示，Mametacaspase?9 與Mbmetacaspase?9 有高度的同源性，其次是Zometacaspase?9?like 和OsZIFL1（Zinc Induced Facilitator?Like 1），與Lsmetacaspase?9 同源性較低。

圖3 MaMC6 與其他植物的系統進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of MaMC6 and other plants

對MaMC6 蛋白二級結構進行預測，MaMC6 含有28.12%的α-螺旋、11.25%的β-折疊和60.62%的無規則卷曲。三級結構預測如圖4 所示。

圖4 MaMC6 蛋白三級結構預測Fig. 4 Prediction of the 3-three-dimensional structure of MaMC6 protein

MaMC6順式作用元件分析（圖5）表明其含有較多的光響應元件，另外還含有防御和應激、玉米素代謝調控、茉莉酸甲酯、赤霉素、脫落酸等激素響應元件。其中防御和應激表明該基因可能受外界脅迫誘導表達，參與香蕉的抗逆。

圖5 MaMC6 順式作用元件分析Fig. 5 Analysis of cis-acting elements of MaMC6

2.3 MaMC6的表達分析

2.3.1 鹽脅迫下MaMC6表達分析 經100 mmol/L NaCl 處理后，以0 h 為對照組，巴西蕉MaMC6的RT?qPCR 結果（圖6）可知，在2 h 時出現顯著上調表達，相對表達量為對照的7.70 倍，隨后表達量開始下降，到24 h 時降至對照的31%。

圖6 MaMC6 在NaCl 處理下的基因表達Fig. 6 Gene expression of MaMC6 under NaCl treatment

2.3.2 鹽脅迫下不同鈣效應劑處理后MaMC6的表達分析 從圖7 看出，CaCl2處理后，基因的表達受到抑制，但仍在2 h 時達到最高峰，為對照的3.99 倍。而鈣離子螯合劑EGTA 和鈣離子通道阻礙劑LaCl3提高了MaMC6在鹽脅迫下的相對表達量，處理期間相對表達量均高于NaCl 處理組，但整體變化趨勢相似，在2 h 時達到最高峰，分別為對照的9.92 和11.20 倍。由此推測，適當添加外源Ca2+可以通過抑制PCD 相關基因的表達，進而緩解由NaCl 誘導的PCD 的發生，通過EGTA 和LaCl3阻礙外源Ca2+進入胞內參與響應鹽脅迫的調控則會加速PCD的發生。該基因的表達受到外源Ca2+的影響。

圖7 不同鈣效應劑對鹽脅迫下MaMC6 表達的影響Fig. 7 Effects of different calcium effectors on the expression of MaMC6 under salt stress

2.4 MaMC6亞細胞定位分析

瞬時轉化煙草葉片細胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核和細胞膜上有GFP 熒光信號，表明MaMC6?GFP 融合蛋白呈現出細胞質和細胞核定位模式（圖8）。

圖8 MaMC6 亞細胞定位Fig. 8 Subcellular localization of MaMC6

2.5 MaMC6在BL21中對非生物脅迫的響應

從圖9 可知，在LB 培養基上的對照菌和重組菌的生長情況沒有明顯差別。而在含有800 mmol/L NaCl 和800 mmol/L 甘露醇的LB 培養基上，菌落生長情況在菌液稀釋到10-2梯度時已經出現明顯差異，表達MaMC6 蛋白的重組菌的生長情況要優于對照菌。高溫脅迫下培養的結果顯示，pET28a?MaMC6菌落生長情況在菌液稀釋到10-2梯度時開始出現差異，此時重組菌的生長情況要優于對照菌,到10-3梯度時高溫基本抑制了含有空載pET28a 質粒的對照菌的生長，而此時表達MaMC6 蛋白的菌落仍具有活力。以上結果表明，MaMC6的表達能提高大腸桿菌BL21 的耐鹽、耐滲透和耐高溫能力。

圖9 MaMC6 在大腸桿菌BL21 中的功能驗證Fig. 9 Functional verification of MaMC6 in Escherichia coli BL21

3 討論

Metacaspases（MCs）屬于植物類caspases 酶的半胱天冬氨酸酶類，通過激活下游具有類caspase 活性的蛋白酶，參與植物生長發育以及響應生物和非生物脅迫誘導的PCD 過程［11］。從香蕉A 基因組數據庫鑒定到的MaMC6，利用生物學信息分析基因的特性。氨基酸序列多重比對以及系統進化樹分析結果顯示，MaMC6 屬于II 型metacaspases，與唐露等［24］分析結果相似?？缒そY構預測顯示MaMC6 沒有跨膜結構，保守結構域分析發現只含有一個caspase?like domain 與水稻和擬南芥一致［18］。順式作用元件分析顯示其含有防御和應激響應元件，猜測可能與香蕉的抗逆有關。

Metacaspase 在參與植物PCD 過程中的作用機制是復雜的，在擬南芥中AtMC1和AtMC2拮抗控制細胞死亡［12］；過表達辣椒CaMC9，增強植株對病原體的敏感性和細胞的死亡率［32］；水稻OsMCs基因經鹽脅迫后的表達情況存在差異，過表達OsMC4基因有助于提高水稻對鹽脅迫的耐受性［19,33］。香蕉根系響應鹽脅迫的轉錄組學研究結果顯示，外源Ca2+對鹽脅迫誘導香蕉幼苗根系PCD 的調控可能與MaMCs有密切聯系［34］。本實驗用100 mmol/L NaCl對巴西蕉細胞進行人工模擬鹽脅迫，使用RT?qPCR分析MaMC6的表達情況?；虮磉_分析結果顯示，MaMC6在2 h 時的上調表達倍數較高。與唐露等［24］在高濃度鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）誘導香蕉組培苗MaMCs表達中的結果存在一定差異，這可能和實驗材料以及脅迫強度不同有關。另外，在煙草、豌豆、番茄、大豆等植物中均發現［Ca2+］cyt會影響PCD的發生［35-38］。為驗證Ca2+是否會影響MaMC6的表達，本實驗在鹽脅迫基礎上添加不同鈣效應劑，然后測定MaMC6的相對表達量。結果發現，CaCl2會降低MaMC6的表達，而EGTA 和LaCl3導致MaMC6的表達升高，這可能與Ca2+能夠緩解植物鹽脅迫有關。

對MaMC6進行亞細胞定位實驗，MaMC6呈現出細胞質和細胞核定位模式，這與擬南芥AtMC9（Atmetecaspase?9）亞細胞定位結果相似［39］，并且MaMC6和AtMC9在進化分析中有一定的同源性。為進一步鑒定MaMC6的功能，構建重組質粒pET28a?MaMC6，將其轉入大腸桿菌中分析該基因對脅迫的耐受性發現，重組菌株在NaCl、甘露醇和高溫脅迫下的生長情況均優于對照，推測MaMC6可能是香蕉抗逆的候選基因。

目前， 關于香蕉MaMCs以及Ca2+與mete?caspase 的研究較少。本實驗從巴西蕉細胞中克隆到MaMC6，初步驗證了該基因可受鹽脅迫誘導表達并且其表達情況還受Ca2+影響，原核表達驗證了MaMC6 對鹽、干旱和高溫脅迫的耐受性，為香蕉metecaspase 基因家族響應非生物脅迫的分子機制研究提供了參考。

4 結論

從巴西蕉細胞中克隆到MaMC6，該基因編碼320 個氨基酸，屬于穩定親水蛋白，不含有跨膜結構，為II 型metacaspase，含有光、激素等響應元件。MaMC6受鹽脅迫誘導表達，且在鹽脅迫下的表達受Ca2+影響。MaMC6 呈現細胞質和細胞核定位。MaMC6的表達能提高大腸桿菌的耐鹽、滲透和高溫的能力。