基于SSR 標記的廣東黃皮種質資源遺傳多樣性分析及分子身份證構建

陸育生 彭程 常曉曉 邱繼水 陳喆 陳慧瓊

（廣東省農業科學院果樹研究所 農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640）

黃皮（Clausena lansium（Lour.）Skeels）屬蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideae）黃皮屬（ClausenaBurm. f.），是多年生小喬木、熱帶亞熱帶常綠果樹［1］，原產于我國南部，主要分布在廣東、廣西、福建、海南、云南以及我國臺灣等地［2］。黃皮果實外觀獨特，風味酸甜可口，更具有止咳化痰、消暑健胃、抗氧化、抑腫瘤、防老年癡呆等功效［3-6］。近年來，荔枝（Litchi chinensisSonn.）、龍眼（Dimocarpus longanLour.）等大宗水果價格持續低迷，黃皮的售價相對喜人，給果農帶來了較高的經濟收益，栽培面積持續擴大，已成為華南地區農業供給側結構性改革和實施鄉村振興戰略的重要經濟樹種。廣東省是中國最重要的黃皮產區之一，種植面積和產量均居全國首位，其中，僅云浮市郁南縣栽培面積就超過1 萬hm2，占全國總面積一半以上，并建成我國首個黃皮現代農業產業園，初步形成了涵蓋種植、加工、科技、流通、銷售、文旅、餐飲的全產業鏈條，所產果品成功走出國門，遠銷北美、中東等國家（http://dara.gd.gov.cn/zfjy/content/post_3979099.html）。

但是黃皮作為小宗果樹，育種工作長期未受到足夠重視，導致目前主栽品種單一且口感不盡如人意，例如栽培面積最大的無核黃皮雖然可食率高，但風味偏酸，無法滿足消費者對高品質水果的需求，而從城甜黃皮雖然口感偏甜，但缺乏風味且易于引起膩感，同樣對消費者的消費熱情產生了不利影響。近年來，伴隨著消費升級，消費者對高品質水果的需求日益高漲，黃皮品種的改良與創新已刻不容緩。廣東黃皮栽培歷史悠久，加之民間習慣屋前房后實生種植，經過長期的自然變異和人工選擇，形成了豐富的種質資源和各具特色的地方品種，可為黃皮遺傳改良和新品種培育提供廣闊的遺傳基礎。然而，由于黃皮為小宗果樹，種質資源研究基礎薄弱，缺乏系統的分類鑒定，其龐大的種質資源易造成種質混亂。特別是隨著黃皮產業的不斷壯大，各地相互引種和種質交流頻繁發生，導致“同名異物”或“同物異名”現象屢見不鮮。這不僅給黃皮種質資源的保護、管理和開發利用帶來很大困難，而且也極大損害育種者和種植者的權益。因此，系統開展廣東黃皮種質資源的遺傳多樣性和親緣關系研究，有利于準確區分和鑒定黃皮種質，對于黃皮產業的健康發展具有重要意義。

種質資源鑒定評價的傳統手段是采用形態學標記，其具有簡單和直觀的優點，但其易受環境及植物生長發育狀態等因素的影響，而且誤差大、耗時、費力，因而存在較大的局限性［7］。隨著分子生物學技術的快速發展，DNA 分子標記作為新興的標記技術，能很好地彌補形態標記的不足，已被廣泛應用于植物種質資源鑒定研究。SSR（simple sequence repeat），又稱微衛星DNA（microsatellites），是由1-6個核苷酸為重復單元組成的簡單串聯重復序列［8］，重復單元數量的差異造成了種質資源間豐富的遺傳多態性。作為第二代分子標記的代表，SSR 分子標記具有技術簡便、多態性豐富、穩定性高、重復性好、共顯性等優點［9-10］，被國際植物新品種保護聯盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV）確定為植物新品種保護應用最廣泛的分子標記體系［11］。

目前，SSR 標記已廣泛應用于蘋果（Malus pumilaMill.）［12-14］、梨（Pyrusspp.）［15-17］、桃（Prunus persica（L.）Batsch）［18-20］、 李（Prunus salicinaLindl.）［21］、板栗（Castanea mollissimaBlume）［22］、柑橘（Citrus reticulataBlanco）［23］、葡萄（Vitis vin?iferaL.）［24-25］、荔枝［26］、火龍果（Hylocereus undatu‘Foo?Lon’）［27］等果樹的遺傳多樣性分析、核心種質篩選、遺傳圖譜構建以及種質鑒定等諸多領域，但關于SSR 標記技術在黃皮種質資源的多樣性分析和分子身份證構建方面的研究尚未見報道。

本研究以農業農村部廣州黃皮種質資源圃保存的84 份廣東黃皮種質為材料，利用項目團隊前期開發的12 對SSR 引物開展遺傳多樣性分析和分子身份證構建，旨在揭示廣東黃皮種質資源的遺傳多樣性水平及親緣關系，從而為黃皮種質資源的合理保護和高效利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的黃皮種質資源共84 份，包括已審定的選育品種、具有一定種植規模的農家品種以及從全省各地收集的地方種質（實生單株）（表1），以上所有種質資源均保存于廣東省農業科學院果樹研究所農業農村部廣州黃皮種質資源圃內。每份種質材料選取新鮮健康的嫩葉1 g，液氮速凍后于?80℃冰箱保存備用。

表1 84 份供試廣東黃皮種質資源Table 1 84 germplasm resources of wampee in Guangdong province

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取與檢測 采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350，天根生化科技有限公司，中國北京）提取黃皮葉片基因組DNA，所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計（Thermo Scientific, USA）進行DNA 質量和濃度檢測，然后用滅菌ddH2O 將各樣品DNA濃度均稀釋至20 ng/μL 備用。

1.2.2 PCR 反應及產物的毛細管電泳檢測 試驗所用的SSR 引物為項目團隊前期從黃皮轉錄組序列開發［28］獲得的12 對多態性引物（表2）。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，在上游引物的5'端加1 個熒光素標記（carboxyfluorescein,FAM）。PCR 擴增反應體系20.0 μL，包括2× Taq PCR mix 10.0 μL、5 μmol/L 正、反向引物各1.0 μL、20 ng/μL DNA 模板1.0 μL 和ddH2O 7.0 μL。擴增程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，35 個循環；72℃ 10 min，4℃保存。PCR 產物稀釋10 倍，取1 μL 加入96 孔板中，再加入甲酰胺和分子量內標GeneScan 500 LIZ（Thermo Fisher Scientific,USA）混合液（9.5∶0.5，體積分數）9 μL，95℃ 5 min，然后迅速冰上冷卻10 min，3 000 r/min 離心1 min，在ABI 3730 上進行自動熒光檢測。

表2 供試SSR 引物信息Table 2 Information of SSR primers used in this study

1.2.3 數據處理與分析 電泳結束后，利用軟件GeneMapper 4.0 對原始數據進行分析，獲得每對引物在不同樣品上的擴增片段；采用Powermarker 3.25［29］和Popgene 32［30］計算等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態性信息量指數（PIC）和Shannon信息指數（I）；使用Power Marker 3.25 計算各資源間的Nei's 遺傳距離，隨后基于非加權分組算術平均 法（unweighted pair?group method with arithmetic means, UPGMA）在FigTree 1.4.3 中構建聚類樹；使用Structure 2.3.4［31］基于貝葉斯聚類方法分析黃皮種質資源的群體結構，設不作數迭代（length of burnin period）開始時的馬爾科夫鏈蒙特卡洛（MCMC）為10 000 次，不作數迭代后的MCMC（mumber of MCMC reps burnin）為100 000 次，采用混合祖先模型（admixture model）和等位變異發生頻率相關模型（allele frequency correlated model），群體數目（K）設為1-10，對每個K值模擬運算10 次，運算結果以Zip 格式進行壓縮，提交給在線軟件Structure harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/），以判斷群體的Clusters 數（即最可能的K值）。

1.2.4 分子身份證構建 根據12 對引物在各樣品中擴增的帶型，按分子量將條帶從小到大排序，每一種帶型用個位阿拉伯數字1-9 編碼表示，帶型數超過9 的用小寫英文字母a-z 依次表示，將每個樣品在12 對引物上的擴增帶型數據串聯起來，即得到每個樣品以12 位數字或字母表示的分子身份證。

2 結果

2.1 廣東黃皮種質資源SSR位點多態性分析

利用12 對SSR 引物對84 份廣東黃皮種質資源進行擴增和熒光毛細管電泳檢測，并計算獲得各遺傳多樣性參數（表3）。12 個SSR 位點共檢測到43 個等位基因（Na），每對引物檢測到的等位基因為3-6 個，平均等位基因3.583 個。有效等位基因（Ne）為1.416-2.984，平均值為2.187。觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）變化范圍分別為0.265（CP006）-0.675（CP010）和0.294（CP006）-0.665（CP007），平均值分別為0.497 和0.524。Shannon 信息指數（I）變化范圍為0.567（CP006）-1.096（CP006），平均I為0.913。各引物的多態性信息含量（PIC）分布范圍為0.291-0.642，平均PIC值為0.484，其中CP010 最大，CP006 最小。12 個SSR 位點的PIC值均大于0.25，其中6 個位點的PIC值大于0.50。

表3 12 對SSR 引物的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity at 12 pairs of SSR markers

2.2 聚類分析

根據12 對SSR 引物的擴增結果，利用Power Marker 軟件對84 份廣東黃皮種質資源進行基于UPGMA 方法的聚類分析。結果（圖1，表4）表明，全部資源可以劃分為6 個類群，第I 類群包含13 份種質，除了‘陽山雞心’外，其他種質均來自廣東西部地區的湛江和云浮。第II 類群包含8 份種質，均來自廣東東部地區的梅州和潮汕。第III 類群包含11 份種質，除了‘陽山大葉’‘連南2 號’‘連南3號’‘龍門9 號’外，其他種質均來自廣東西部地區的云浮和陽江。第IV 類群包含6 份種質，除了‘始興032’外，其他種質均來自廣東中部地區的惠州。第V 類和第VI 類為培育品種和農家品種，來源地分散在廣東各地，其中，第V 類包含30 份種質，除‘番禺甜皮’‘白糖黃皮’‘蘿崗獨核’‘小果甜皮’‘塔下甜皮’外，其他均為雞心黃皮類，特征是果實均為圓卵形或橢圓形、肉質細嫩、風味甜酸適中。‘潮州11 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’完全聚在一起，推測這4 份種質為同物異名種質。第VI 類群包含16 份種質，除‘龍門1 號’‘龍門10 號’‘龍門8 號’外，其他均為甜黃皮類，特征表現為果皮淺黃色、肉質脆嫩、風味清甜、無酸味。

圖1 基于SSR 標記的84 份種質資源聚類圖Fig. 1 Cluster diagram of 84 wampee germplasm resources based on SSR markers

2.3 遺傳結構分析

進一步利用structure 軟件構建廣東黃皮種質資源的群體居群遺傳結構圖，結果顯示，84 份種質在K=2 時，ΔK有最大值（圖2），此時84 個樣本可分為2 個亞群（圖3）。亞群A 包含39 份資源，除了來自云浮的‘區根甜皮’、廣州的‘祿田獨核’和惠州的‘龍門10 號’等農家品種外，其他種質均為來源于全省各地的地方種質；亞群B 包含45 份資源，除了地方種質‘始興032’和‘龍門7 號’外，其他種質均為選育品種和農家品種，結果與UPGMA聚類分析結果一致。84 份材料中有79 份材料在某一類群的同系得分（Q 值）>0.6，占94.05%，表明供試的黃皮種質遺傳結構較為簡單，但群體間仍有少量種質混雜，存在相互的基因滲透。

圖3 K=2 時基于SSR 標記的84 份黃皮種質群體遺傳結構Fig. 3 Genetic structure of 84 wampee germplasm and population at K=2 based on SSR markers

2.4 分子身份證構建

按表3 引物的順序將所有引物在樣品中擴增出來的基因型（帶型）的分子量大小進行賦值排序（表5），串聯排列后獲得供試84 份黃皮資源的分子身份證代碼（表6），在同一位置代碼相同則表示基因型相同。其中，推測為同一種質的‘潮州11 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’具有相同的分子身份代碼，其余種質均具有專屬的分子身份代碼。

表5 12 對SSR 引物的擴增帶型編號Table 5 Amplified band codes of 12 pairs SSR primers

3 討論

遺傳多樣性是生命系統的基本特征，是物種適應自然和發生進化的產物，開展遺傳多樣性分析對種質資源的有效保護、開發和利用具有重要意義。目前，關于DNA 分子標記在黃皮種質資源遺傳多樣性分析中的應用僅有少數報道，劉小梅等［32］利用10 對RAPD（random amplified polymorphic DNA）標記對來自廣東、廣西和海南的36 份材料進行研究，結果表明上述黃皮種質間的親緣關系較近。李開拓等［33］利用15 對ISSR（inter?simple sequence repeat）引物對來源于福建、廣東和廣西的40 個黃皮品種（品系）進行遺傳多樣性分析，結果也表明黃皮品種（品系）間的遺傳相似性較大。本研究在前期基于轉錄組序列的黃皮SSR 標記挖掘的基礎上［28］，首次利用12 對SSR 熒光引物對來源于廣東的84 份黃皮種質資源進行基因分型和遺傳多樣性分析。多態性信息含量（PIC）和期望雜合度（He）是衡量種群遺傳多樣性的重要指標，PIC反映SSR 位點的變異程度，當PIC≥0.5 時表示位點具有高度多態性，當0.25

根據SSR 分型數據，采用UPGMA 方法進行聚類分析。結果表明，供試的84 份廣東黃皮種質資源可分為6 個類群，第I-IV 類群為地方種質，其中，第I 和第III 類群大部分種質來自廣東西部地區，第II 類群主要來自廣東東部地區，第IV 類群主要來自廣東中部地區；而第V 類和第VI 類則為具有一定栽培規模的培育品種和農家品種，來源分布于廣東各地。可見，基于UPGMA 的聚類結果與地理分布有一定關聯，但并沒有嚴格按照材料的地理來源進行聚類。關于黃皮種質資源的分類目前尚未有統一標準，傳統習慣按單一形態或園藝性狀進行簡單分類，如按果實風味分為甜黃皮和酸黃皮，按果實形狀分為雞心黃皮、圓果黃皮、牛心黃皮、梨形黃皮，按種子的多少分為有核黃皮和無核黃皮等［32］。本研究結果表明，基于SSR 的分類與傳統形態分類具有一定的相關性，如第V 類群中大部分種質為雞心黃皮類種質，其主要特征是果實均為圓卵形或橢圓形，肉質細嫩、風味甜酸適中；而第VI 類群主要為甜黃皮類，形態特征是果皮淺黃色、肉質脆嫩、風味清甜、無酸味。然而傳統形態分類范圍過寬，且性狀評價容易受主觀和環境因素干擾，難以準確反映種質資源間的親緣進化關系；與之相比，基于SSR 的分類是從DNA 水平揭示種質資源間的差異，能更全面、準確地反映種質間的親緣關系，其結果更加嚴謹、可靠。

分子身份證是在DNA 指紋圖譜的基礎上，采用一定編碼規則對電泳圖譜進行數字化處理，從而獲得字符串形式表示的身份代碼；其克服了指紋圖譜人工比對的繁瑣、低效等問題，能簡單、直觀地區分不同種質，被廣泛應用于種質資源鑒定和品種識別。目前，基于SSR 標記技術已成功構建了葡萄［24］、蘋果［35］、梨［36］、火龍果［27］、山楂［7］等多種果樹種質資源的分子身份證。本研究利用12 對SSR 熒光引物對84 份黃皮種質進行擴增，獲得指紋圖譜，并采用基因型賦值的方式編碼，得到了供試材料的分子身份證。除了推測為同一種質的‘潮州11 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’外，其余種質均具有唯一的分子身份證，可被有效區分，表明SSR標記技術作為一種有效的技術手段，可用于黃皮種質資源的分子身份證構建。

4 結論

廣東黃皮種質資源具有較為豐富的遺傳多樣性，基于UPGMA 方法可將供試材料分為6 個類群，與傳統形態分類相比，SSR 聚類結果更嚴格、準確；基于12 對SSR 引物的分型結果，采用數字加英文字母的編碼方式，成功構建黃皮種質資源的分子身份證。