Notch3/DLL4信號通路對頸部淋巴水囊瘤后淋巴管發育的影響

王榮躍，邱海凡，戴芬，樓文文，宮劍，謝愛蘭

溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江 溫州 325027，1.婦產科；2.檢驗醫學科

胎兒頸部淋巴水囊瘤（cystic hygroma, CH）是常見的一種嚴重先天性發育異常，多發生于早孕期，90%以上發生于頸部，主要臨床特征是由于淋巴管發育異常導致軟組織內出現單個或多個囊腫，其內含有透明或渾濁的液體。CH病因不明、預后評估困難且治療效果差，目前比較公認的病理學說是淋巴管發育的紊亂或延遲[1]。Notch信號通路是一種進化保守的信號系統，在血管及淋巴管發育中發揮重要作用[2]。既往研究表明激活的Notch受體促進內皮細胞表達和分泌血管新生作用因子神經突起導向因子（netrin4, NTN4）[3]。現已證實NTN4能夠直接刺激體外淋巴管生成，也能夠增加淋巴管的通透性[4-5]。但其具體的調控機制尚不明確。鑒于此，本研究擬采用基因編輯技術引入Notch3敲入突變小鼠，探討其在頸部CH中的發病機制研究。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠和F2代Notch3基因敲入突變小鼠各10只，分別為對照組和突變組，雄性，SPF級，6～8周，體質量20～26 g，購自廣州賽業生物有限公司，動物許可證為SCXK（蘇）2018-0003。所有小鼠安置在溫州醫科大學動物實驗中心飼養，飼養溫度控制在22±2 ℃，相對濕度為40%±10%，室內光照維持12 h/12 h日夜交替，自由飲食，飼養2周熟悉環境后用于實驗。本研究所采用動物實驗方案通過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會審核（倫理編號：LCKY2019-231）。

1.1.2 藥品與試劑 蘇木素染液（ZLI-9610，北京中衫金橋公司）；伊紅染色液（G1100，美國Solarbio 公司）；Scott藍化液（G1865，美國Solarbio公司）；改良Masson試劑盒（G1340，美國Solarbio公司）；血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）3抗體（AF4201，美國Affinity公司）；血管生成素2（angiopoietin 2,Ang2）抗體（12316-1-AP，美國Proteintech公司）；delta樣配體4（delta-like ligand 4, DLL4）抗體（DF13221，美國Affinity公司）；發狀分裂相關增強子1（hairy and enhancer of split 1, Hes1）抗體（DF7569，美國Affinity公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金橋公司）；DAB顯色試劑盒（CW0125，美國CWBIO公司）；中性樹脂（CW0136，美國CWBIO公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構建 人Notch3基因序列與小鼠的基因序列高度同源，申請人課題組在前期研究中發現了一個致病性錯義突變位點（c.3044G＞A，p.Cys1015Tyr），保守性分析顯示該氨基酸在不同種類脊椎動物中高度保守[3]。本研究采用CRISPR/CAS9基因編輯技術構建Notch3基因Cys1015Tyr突變敲入（knock-in）小鼠模型，觀察到F2代Notch3敲入突變小鼠均發生明顯的頸部淋巴結腫大、合并心臟畸形等發育缺陷的表現，提示造模成功。

1.2.2 HE染色 各組模型建立后，采用心臟灌流的方法處死小鼠，取頸部淋巴結固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，按照常規切片5 μm后保存。染色前65 ℃干烘箱中進行脫蠟2 h，二甲苯浸泡10 min兩次，隨后梯度乙醇水化，蘇木素染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.2.3 Western blot檢測 取小鼠頸部淋巴結，加入裂解液，勻漿，4 ℃離心機取上清液，采用考馬斯亮藍測定蛋白濃度，配置40 μg的蛋白體系，-80 ℃保存樣品。選取合適的分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍跑至底端后停止電泳。取出凝膠，甲醇激活PVDF，冰浴條件下進行電轉。隨后使用快速封閉液，室溫搖床封閉30 min。4 ℃搖床過夜孵育一抗后常溫孵育二抗1 h，最后用曝光機采集相應圖像，使用ImageJ分析各自的灰度值。每組實驗重復3次。

1.2.4 免疫組化檢測 采用心臟灌流的方法處死小鼠，取頸部淋巴結用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋，切片后保存。染色前65 ℃干烘箱中進行脫蠟45 min，二甲苯浸泡15 min兩次，隨后梯度乙醇水化，3% H2O2常溫浸泡10 min去除內源性的過氧化氫酶，采用檸檬酸緩沖液高壓鍋高壓修復，自然冷卻室溫，5% BSA于37 ℃烘箱封閉1 h，后配置適當比例的一抗4 ℃過夜，隔日配置對應的二抗37 ℃烘箱孵育1 h，采用DAB顯色液進行顯色，蘇木素染色染核，隨后用純化水沖洗，PBS反藍后，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹脂封片鏡檢，顯微鏡下觀察。

1.2.5 RT-qPCR檢測 取小鼠淋巴組織，采用TRIzol提取法提取組織樣本中總RNA，按照10 μL反轉錄試劑配置的反應液，置入梯度PCR儀中進行反轉錄反應。反轉錄形成的cDNA。最后與SYBR Green配置成20 μL的反應體系，并置入實時定量PCR儀器中設置模板，開始反轉錄。PCR引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 統計學處理方法

采用SPSS軟件進行統計學分析，所有實驗均需重復3次。計量資料采用±s表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Notch3敲入突變對淋巴結結構的影響

與對照組比，突變組整體淋巴結構顯著被破壞，細胞分布紊亂（圖1A）。Masson染色結構示，與對照組比，突變組可見大量的藍染，提示淋巴結纖維化嚴重（圖2A）。小鼠頸部淋巴水囊瘤模型已成功建立。

圖1 各組整體形態學觀察

圖2 RT-qPCR測定各組小鼠的淋巴結中DLL4、VEGFR3、Hes1基因表達情況

2.2 Notch3 敲入突變對小鼠淋巴結中DLL4、Hes1和VEGFR3 mRNA表達的影響

與對照組比，突變組小鼠淋巴結中DLL4、Hes1和VEGFR3的mRNA相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.3 Notch3 敲入突變對小鼠淋巴結中DLL4、Hes1和VEGFR3蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組比，突變組小鼠淋巴結中DLL4、Hes1和VEGFR3蛋白相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3A）。免疫組化結果顯示，與對照組比，突變組小鼠淋巴結中DLL4、Hes1、Ang2、VEGFA和VEGFR3蛋白表達顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 Notch3 敲入突變后小鼠淋巴結中DLL4、Hes1、Ang2、VEGFA和VEGFR3蛋白的變化

3 討論

淋巴管的正常發育包括多個步驟，如淋巴管的萌芽、遷移延伸、錨定、淋巴管從血管內皮的剝離、淋巴管的重建與成熟以及淋巴結的發育等。這些步驟都需要一系列的分子調節因子和信號通路的協同作用，包括VEGFR3、VEGF-C、Ang2等。在這些分子和信號通路的調控下，淋巴管才能夠正常地發育和成熟，從而完成其在機體免疫、代謝和廢物清除等方面的重要功能[6]。淋巴管發育延遲或紊亂是指在孕早期頸靜脈淋巴管與早期靜脈系統的分化中，內皮系統的重建延遲，淋巴液及組織液無法進行正常引流，液體堆積形成囊腫；當淋巴管發育完成后，淋巴液及組織液被引流至靜脈，CH隨之消失。如果淋巴管出現發育不良或不發育，淋巴液及組織液將持續聚集，此時形成的CH將不會消失，孕中期也可觀察到[7-9]。臨床CH胎兒頸后組織的病理表現特征為淋巴管顯著增生和擴張，壞死淋巴結增多，血管減少，間質纖維絲束增多、變長[10]。這與本研究發現Notch3敲入突變組小鼠的頸部淋巴結腫大、合并心臟畸形等發育缺陷的表現，及HE和Masson染色結果高度一致，這提示Noth3信號通路參與CH的發病。

DLL4是Notch的配體家族之一，與相應的受體結合后，能夠激活Notch信號通路，促進下游基因Hes1的轉錄和表達。Notch3作為一種跨膜受體蛋白， 在淋巴管發育中發揮著關鍵作用。研究表明Notch3基因能夠調控淋巴管內皮細胞的生長、分化和分布等過程，從而影響淋巴系統的形成和功能[11]。同 時，Notch3基因還可以與其他信號分子相互作用，參與淋巴管的分支、連接和排列等復雜過程，對淋巴系統的結構和功能進行調節和控制[12]。研究表明激活的Notch1受體促進內皮細胞表達和分泌NTN4[3]。NTN4不僅可以直接刺激體外淋巴管生成，導致淋巴增生異常，同時也能夠激活Rac1、RhoA和SFK磷酸化，增加淋巴細胞的通透性，促進頸部皮膚組織間液的滲透聚集，最終導致頸部CH的形成[4-5]。 也有研究表明Notch信號通路參與血管內皮和淋巴管的形成[13]。Ang2是血管內皮形成和重塑的的關鍵因素之一，參與多種腫瘤疾病的發生發展。淋巴管的發育離不開血管內皮的形成，因此，猜測Notch信號通路對淋巴管發育的影響是通過對血管內皮的調節實現的。本研究結果也證實了筆者的猜測，Notch3敲入突變組小鼠存在頸部淋巴結腫大，合并心臟畸形等臨床表現，其淋巴結結構紊亂、纖維化嚴重等均表明Notch信號通路是頸部CH的重要發病機制之一。RT-qPCR和Western blot結果顯示突變組VEGFR3的蛋白和基因表達顯著下降，免疫組化結果顯示突變組Ang2、VEGFA、VEGFR3表達減少，這表明Notch3突變后其血管內皮新生的指標均降低，抑制淋巴管血管內皮的生長、發育及重塑。

最新的單細胞測序顯示臨床樣本中內皮細胞亞群中篩選出881個差異表達基因，其中只有Hes1基因參與淋巴管分化及發育相關，且Hes1基因位于 Notch信號通路上[14]。本研究結果顯示在Notch3突變組小鼠淋巴組織中可以看到Hes1的mRNA水平和蛋白的表達均顯著下降。先前研究表明VEGF-C及其受體VEGFR3信號通路參與了淋巴管的出芽過程[15-16]。 敲除小鼠的VEGF-C基因，Prox-1陽性的淋巴管內皮祖細胞無法從主靜脈中脫離[15]。此外，在小鼠胚胎中發現VEGFR3的酪氨酸激酶活性結合區域是誘導淋巴管內皮祖細胞從靜脈出芽和脫離的關鍵[17]。VEGFR3是最先發現的淋巴管內皮標記物之一，在發育的早期階段VEGFR3存在于所有的內皮中，隨著淋巴管系統的發育完善，VEGFR3的表達變得僅限于淋巴管內皮細胞[18-19]。這些研究表明無論是VEGF-C還是VEGFR3的酪氨酸激酶缺失都會使淋巴管內皮祖細胞出芽障礙，從而影響淋巴管的發育。RT-qPCR和Western blot結果顯示在Notch3突變組小鼠淋巴組織中可以看到VEGFR3的水平顯著下降，免疫組化結果顯示Notch3突變組小鼠淋巴組織中可以看到VEGFR3和VEGFA的水平顯著下降。這表明Notch3突變后會導致淋巴組織內血管內皮發育成熟障礙，提示淋巴管血管內皮發育障礙可能是Notch3敲入后導致小鼠CH的潛在發病機制之一。

Ang2作為血管生成素的一種，有研究發現小鼠淋巴管形成過程中Ang2在淋巴內皮細胞中的表達。在最早的淋巴前體細胞募集階段，淋巴前體細胞的細胞質中顯示了Ang2呈強陽性，這表示Ang2可能能夠調整淋巴管的出芽[20]。阻斷Ang2會發現其新生淋巴管發育不全，生成形狀不規則的混亂的淋巴管。這些研究表明Ang2對于淋巴管的形成和穩定是必需的[21]。免疫組化檢測發現，Notch3突變組小鼠淋巴組織中可以看到Ang2的表達顯著下降，表明Notch3突變后抑制Ang2的水平，阻礙淋巴管出芽導致新生淋巴管發育不全，極有可能是導致突變組頸部淋巴水腫的原因之一。

DLL4為Notch通路的配體之一，與受體結合激活Notch通路，而Hes1基因為其下游基因，既往研究表明VEGFR3、VEGFA、Ang2參與淋巴管血管新生。本研究引入Notch3突變鼠后發現小鼠頸部淋巴組織明顯水腫，病理學染色結果顯示淋巴結構紊亂，纖維化嚴重，表明Notch3信號通路可能為胎兒頸部CH的發病機制。結合目前較為公認的學說是淋巴管內皮發育延遲是CH的主要病理生理過程。由此猜測Notch3突變后影響了小鼠淋巴管內皮的發育。通過檢測Notch3突變后小鼠頸部淋巴組織內VEGFR3、VEGFA、Ang2等內皮血管生長發育的指標發現其顯著降低，表明Notch3突變后血管淋巴內皮的生長、出芽、發育都被顯著抑制。由此Notch3信號通路可能參與CH的發病機制極有可能是通過抑制淋巴血管內皮的生長發育。