雞壞死性腸炎病原菌的分離與鑒定

陳 成，孫思楠

（六安市裕安區農業農村局 237010）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是革蘭陽性粗大桿菌，屬厭氧菌，但對厭氧的要求不高，廣泛存在于自然界的水源、土壤、塵埃中。產氣莢膜梭菌在不同動物的身上都有致病性，可引起人及動物的創傷性壞疽[1－3]，導致了較為嚴重的食品安全問題。各型產氣莢膜梭菌均含有α 毒素 （CPa）基因，α 毒素被認為是最基本、最重要的致病因子[4]。本文對淮南市某肉雞養殖戶送檢的疑似壞死性腸炎的病死雞進行了病原菌的分離與鑒定，并對其進行了藥敏試驗，生化試驗，動物接種試驗等來確定其相關的特性。在六安的周邊地區，許多養殖戶所養的雞都因為壞死性腸炎而有所虧損。由于雞壞死性腸炎發病的廣泛性和難以防治，給養殖戶帶來大量的經濟損失。壞死性腸炎被認為是影響肉雞行業的全球疾病之一，壞死性腸炎不但影響雞的生產性能而且易引發一些其他的疾病，造成嚴重的損失。此外由于許多養殖人員和獸醫工作人員對此病的認識不足，重視不夠也會造成許多不必要的損失。由此，對雞壞死性腸炎的研究，進行分離和鑒定，對于指導雞壞死性腸炎的預防和治療有重大意義，也豐富了雞壞死性腸炎的流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

健康家兔一只，昆明小鼠四只。

1.1.2 病料

一只病死雞的肝和腸道。

1.1.3 培養基

厭氧肉肝湯、生化試驗培養基、糖發酵培養基、分離培養基、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶（SPS）瓊脂培養基。

1.1.4 藥敏紙片

卡納霉素，頭孢噻吩，麥迪霉素，頭孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，頭孢他啶，復方新諾明，頭孢吡肟，米諾環素，諾氟沙星，克拉霉素，環丙沙星，氧氟沙星，頭孢噻肟，慶大霉素，頭孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素。

1.1.5 主要儀器及試劑

DK-8D 電熱恒溫水槽（上海醫用恒溫設備廠），高速離心機（德國Eppendorf 公司），LDZX-SOFBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），培養箱（力康生物醫療科技股份有限公司），天平（上海醫用激光儀器廠），培養皿，試管，量筒，三角燒瓶，玻璃棒，超凈工作臺（上海三發科學儀器有限公司），pH 試紙，電磁爐，試管塞，包裝紙扎繩，酒精燈，接種環，各種類型針頭，搪瓷缸。

1.2 方法

1.2.1 培養基制備

1.2.1.1 厭氧肉肝湯的制備

肉肝浸液1000 mL；蛋白胨10 g；氯化鈉5 g；葡萄糖2 g；pH 調至7.6～7.8。

首先，取去筋膜及脂肪的牛肉和去筋膜的肝250 g，將其切成小塊，加入1000 mL 水，攪拌均勻，冷浸20～24 h。然后取出，加熱煮沸20～60 min，注意不要沸騰時溢出。補足水量，用紗布過濾，棄去肉渣及肝塊。然后，在肉肝湯中加入蛋白胨，氯化鈉，加熱溶解，調節pH值。煮沸10～20 min，冷卻后加入已經混勻的肉肝湯浸液，加入葡萄糖混勻。將煮過的肝塊，用水沖洗后切成寬0.5 cm 以下的小方塊，用水沖洗后分裝試管，加入已經混勻的肉肝湯，比例為1∶10。最后再加蓋3～4 mm 厚的液體石蠟，116℃，30～40 min。

1.2.1.2 sps 培養基的制備

胰蛋白胨15 g，酵母浸膏10 g，檸檬酸鐵0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2

加熱煮沸1～2 min，溶解。將溶解后的溶液迅速放入高壓滅菌鍋中121℃高壓維持15 min。每升中加入下列過濾除菌溶液：100 g/L NaSO37H2O 5 mL；1.2 g/L 多粘菌素B 硫酸鹽溶液10 mL；1.2 g/L 磺胺嘧啶鈉溶液10 mL。

1.2.2 細菌增菌培養

從病死雞的腸道中用無菌接種環刮取病變組織，穿刺接種到已經分裝好的厭氧肉肝湯中，點燃酒精燈，灼燒接種針滅菌。左手執試管，右手執接種環，從病變組織中挑取少許病變組織，刺入肉肝湯內，深度接近試管底部，但不可過深。接種后抽出接種針，將試管塞和試管口迅速在火焰上灼燒殺菌后，將試管塞塞回試管口。再將多余在接種針的細菌在火焰上燒毀。接種完畢后，在試管上做好菌名、日期等標記，放在恒溫培養箱中恒溫培養24 h。24 h 后肉眼可見肉肝湯變得少許渾濁。用離心機高速離心，3500 r/min 離心10 min，可在試管底部看見白色沉淀物。涂片革蘭氏染色后油鏡下觀察到大量短柱狀菌體。

1.2.3 細菌的分離培養

首先將sps 培養基傾倒分裝到培養基內。然后將肉肝湯中的菌體接種到該分離培養基中，點燃酒精燈，灼燒接種環，滅菌。左手執培養皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精燈的地方將培養皿打開約20o左右，右手執接種環，從肉肝湯中刮取少量液體，用劃線法在培養基中劃線接種。接種結束后，迅速蓋好培養皿。在其背面標注好菌名、日期標記。整個操作過程中注意無菌操作。完成后，將培養基放在37℃的恒溫培養基中，隔夜培養。培養后觀察細菌形態，革蘭氏染色，鏡檢，用厭氧肉肝湯對單個菌落進行純培養。培養后采取革蘭氏染色，鏡檢細菌形態、染色特征。

1.2.4 生化試驗

將獲得的細菌純培養產物，分別接種在麥芽糖培養基、葡萄糖培養基，乳糖培養基、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水上，培養后觀察各個培養基的試驗現象。

1.2.5 動物接種試驗

試驗動物分別為小鼠和家兔。首先采用腹腔注射的方法，將在分離培養中獲得的細菌純培養產物注射到小鼠體內。正常飼喂24 h 后，制作心臟的血涂片。在載玻片上滴加一滴清水，破開小鼠腹部，取出心臟，用灼燒后的手術刀切入小鼠心臟，然后采用無菌操作的方法，點燃酒精燈，灼燒接種環，滅菌。左手執培養皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精燈的地方將培養皿打開約20o左右，右手執接種環，從小鼠心臟的開口處刮取少量血液，將血液在載玻片清水上均勻涂開，待其正常干燥后待作鏡檢。同時也制作健康小鼠的心臟血液涂片作對比觀察。

在對家兔的實驗中，采用靜脈注射的方法將細菌純培養物注入到家兔體內。立即處死，將尸體在恒溫箱內保存24 h。同上述一樣的方法，取出兔子肝臟，觀察肝臟病理變化，并制作肝觸片，同時也做一組空白對照，取一只健康家兔的肝臟制作觸片進行對比觀察。

1.2.6 藥敏試驗

將細菌純培養產物加少許培養基中進行藥敏試驗。用到的藥物有：卡那霉素，頭孢噻吩，麥迪霉素，頭孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，頭孢他啶，復方新諾明，頭孢吡肟，米諾環素，諾氟沙星，慶大霉素，環丙沙星，氧氟沙星，頭孢噻肟，頭孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素等。

2 試驗結果

2.1 增菌培養結果

將離心后的增菌液底部菌體，挑取少許在油鏡下觀察，看到較多的是一些短大，呈橢圓形，兩端鈍圓的桿菌，為革蘭氏陽性菌。

2.2 分離培養結果

首先在sps 培養基上看到了許多黑色圓形菌落生長。挑取黑色菌落做成涂片在油鏡下觀察，涂片中的細菌大小形態一致，可判斷為同一菌體。菌體呈革蘭氏陽性，兩端鈍圓，橢圓形短大有莢膜的桿菌。查閱相關資料推測該菌為產氣莢膜梭菌[1]。

2.3 生化試驗結果

表1 糖發酵試驗結果

表2 其他生化試驗結果

從糖酵解表中可以看出該菌對葡萄糖，麥芽糖，乳糖的酵解均有產酸產氣現象。而該菌的甲基紅試驗和吲哚試驗均顯示為陰性，vp 試驗和枸櫞酸鹽試驗的結果均顯示為陽性。這些現象均符合產氣莢膜梭菌的生化試驗特征。

2.4 動物接種試驗結果

2.4.1 接種家兔的試驗結果

在家兔的肝臟表面和內部均發現了大量因為氣泡而產生的氣孔，該病理變化符合產氣莢膜梭菌的病理變化特征。對接種的家兔肝臟進行觸片，革蘭氏染色觀察，在油鏡下可清楚的看到肝臟有大量的短粗，兩頭鈍圓的革蘭氏陽性菌落。這也符合產氣莢膜梭菌的細菌形態學。

2.4.2 接種小鼠的試驗結果

接種小鼠在24 h 內全部死亡。對死亡后的小鼠心臟做心血涂片，革蘭氏染色。在油鏡下也可清楚的看到短粗，兩頭鈍圓的橢圓形革蘭氏陽性菌體。

2.5 藥敏試驗結果

從表中可以看出，頭孢他啶對該菌的抑制最為明顯。其次哌拉西林、米諾環素、頭孢噻肟、妥布霉素、頭孢哌酮、氯霉素、克林霉素對其抑制也較為明顯。其中麥迪霉素、復方新諾明、頭孢吡肟、環丙沙星對其影響較小。

表3 藥敏試驗結果

3 討論與小結

試驗分離鑒定了病死雞的肝和腸道細菌，經生化試驗、動物接種試驗、藥敏試驗，可確定該病原菌為產氣莢膜梭菌。首先sps 培養基生長出了黑色菌落，據相關資料表明[5-6]，產氣莢膜梭菌在sps 培養基生長出的菌落即為黑色菌落。其次在顯微鏡下觀察到的細菌形態也符合產氣莢膜梭菌的細菌形態學。我們同時對該菌進行了生化檢測，檢測結果表明，該菌的生化性質和產氣腸桿菌的生化性質相似。在動物接種試驗中，腹腔接種小白鼠24 h 內全部死亡，在其心血涂片中發現了該菌的存在，證明該菌具有較強的致病性。接種的家兔在其肝臟發現了產氣莢膜梭菌所產生的特征性病變。由以上四點可以推測出引起雞壞死性腸炎的病原菌為產氣莢膜梭菌。藥敏試驗結果表明，頭孢他啶對該菌的抑制最為明顯。其次哌拉西林、米諾環素、頭孢噻肟、妥布霉素、頭孢哌酮、氯霉素、克林霉素對其抑制也較為明顯。其中麥迪霉素、復方新諾明、頭孢吡肟、環丙沙星對其影響較小。