克雷伯菌P3生產靈菌紅素的工藝研究

王坤陽 李夢 溫少紅 焦緒棟

摘要? ［目的］為了提高靈菌紅素產率，對實驗室分離保存的一株產酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）P3產靈菌紅素的發酵條件進行優化。［方法］利用液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）分析提取物成分和相對分子質量，通過搖瓶培養對克雷伯菌P3的發酵條件（溫度、pH、NaCl濃度、誘導糖）進行研究。［結果］發酵培養產生的紅色素經過LC-MS分析證明為靈菌紅素，相對分子質量為324.27。確定克雷伯菌P3產靈菌紅素的最佳發酵條件為24 ℃、pH 7.2～8.0、NaCl濃度0.05%～0.10%，2%果糖誘導。［結論］克雷伯菌P3的發酵產物為靈菌紅素，優化后靈菌紅素的產量為90～130 mg/L。

關鍵詞? 產酸克雷伯菌；靈菌紅素；工藝條件優化

中圖分類號? TQ920.6? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）01-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.037

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Process Study on the Production of Prodigiosin by Klebsiella P3

WANG Kun-yang1，2，LI Meng1，2，WEN Shao-hong1 et al

（1.School of Life Sciences， Yantai University， Yantai， Shandong 264005;2. Yantai Coastal Zone Institute， Chinese Academy of Sciences， Yantai， Shandong 264003）

Abstract? ［Objective］In order to improve the yield of prodigiosin， the fermentation conditions of a strain of Klebsiella oxytoca P3 isolated and preserved in the laboratory to produce prodigiosin were optimized.? ［Method］The composition and molecular weight of the extract were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）， and the fermentation conditions （temperature， pH， NaCl concentration， inducing sugar） of P3 were studied by shaking flask culture. ［Result］The red pigment produced by fermentation culture was proved to be prodigiosin by LC-MS analysis， with a molecular weight of 324.27.The optimum fermentation conditions for P3 production of prodigiosin were determined as follows：24 ℃， pH 7.2-8.0， NaCl concentration 0.05%-0.10%， 2% fructose induction. ［Conclusion］The fermentation product of Klebsiella P3 was prodigiosin， and the optimized yield of prodigiosin was 90-130 mg/L.

Key words? Klebsiella oxytoca;Prodigiosin;Process condition optimization

作者簡介? 王坤陽（1996—），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：生物資源利用。*通信作者，高級工程師，博士，從事生物醫藥與醫養健康產品開發等研究。

收稿日期? 2023-02-10

靈菌紅素（prodigiosin，PG）是一類具有三吡咯環骨架結構的天然紅色素家族的總稱，分子式C20H25N3O，最早于黏質沙雷氏菌中被發現［1］。靈菌紅素是由微生物代謝產生的一種紅色素，它存在于微生物細胞的細胞壁內，難溶于水且對光反應敏感，易溶于甲醇、乙醚、乙醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，顏色會隨著溶液體系pH的改變而變化［2］。研究發現靈菌紅素具有抗細菌、抗真菌［3］、抗原生動物［4］等活性，同時也有較強的免疫抑制和抗腫瘤活性［5］以及除藻活性［6］，因此受到廣泛關注。

靈菌紅素的制備主要有化學合成和生物發酵2種方法。20世紀60年代，Rapoport等［7］首次描述了靈菌紅素化學合成的全過程，但該化學合成途徑復雜，反應步驟多、產率低，大規模制備一直未能實現［8］。靈菌紅素的生產目前以微生物發酵法為主，研究內容包括發酵培養基的優化、發酵參數的優化以及對菌種和基因的改造等［9］。生物發酵法對環境友好，制備條件溫和，具備易于工業化生產的優勢［10］。優質菌株缺乏、發酵周期長、產品得率低、生產成本高、純化分離過程復雜等問題仍然是制約靈菌紅素規模應用的瓶頸。該研究對一株實驗室分離保存的產紅色素的克雷伯菌P3進行發酵培養，提取并確認其所產的色素，在此基礎上，對該菌的培養溫度、pH、NaCl濃度、誘導劑類型等進行優化，以期為靈菌紅素的產業化開發提供了條件。

1? 材料與方法

1.1? 試驗菌株

該試驗所用菌株為煙臺海岸帶區域土壤中篩選獲得的一株紅色素產生菌P3，該菌為產酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca），于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏，保藏編號為CGMCC No.7816。

1.2? 培養基

LB液體培養基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min；固體培養基在此基礎上加12 g瓊脂粉。TSB液體培養基：TSB培養基固體30 g，加適量去離子水煮沸溶解，定容至1 L，121 ℃高溫滅菌30 min；固體培養基在此基礎上加12 g瓊脂粉。無機鹽培養基：NaCl 1 g，KH2PO4 1 g，K2HPO4 3 g，NH4HO3 2 g，NH4Cl 1 g，MgSO4 1 g，用去離子水定容至1 L，調節pH 7.0～7.4，121 ℃滅菌30 min。馬鈴薯液體培養基（PDA）：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，加入去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min；固體培養基在此基礎上加15～20 g瓊脂粉。

1.3? 菌種鑒定

將克雷伯菌P3在LB固體培養基上劃線分離培養，觀察平板上菌落形態，并在顯微鏡下觀察記錄其細胞形態。采用CTAB法提取基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增16S rDNA基因，測序結果利用Blast與已報道的序列做對比。

1.4? 菌種發酵

種子液在28 ℃、140 r/min搖床培養24 h后，按1%接種量轉接于無機鹽培養基中，搖瓶培養24 h，觀察發酵液的顏色變化，繼續發酵至48 h。取24 h的發酵液在有光與避光條件下分別放置4 h，觀察發酵液顏色變化。

1.5? 產物的分離提取與分析鑒定

1.5.1

提取色素。按1%接種量吸取種子液轉接于無機鹽培養基中，搖瓶培養24 h，將發酵液分裝于50 mL離心管中離心，回收上清并用等體積的乙酸乙酯萃取，沉淀加入20 mL丙酮充分振蕩，離心提取2次；在圓底燒瓶中加入乙酸乙酯與丙酮的回收液于50 ℃旋蒸至恒重，稱量。將干燥粗提物分別溶于50 mL甲醇溶液和100 mL DMSO溶液中。

1.5.2

酸堿法定性分析提取物成分。取溶于甲醇溶液的樣品，向其中分別滴加鹽酸和氫氧化鈉，觀察其在酸性和堿性條件下的顏色變化。

1.5.3

紫外吸收光譜分析提取物成分。分別取2 μL溶于甲醇溶液及DMSO溶液中的產物粗品，繪制2種樣品的吸收光譜曲線，分析其光譜特征。

1.5.4

液相色譜-質譜聯用（LC-MS）分析提取物成分。取10 μL溶于甲醇溶液的樣品進行LC-MS分析。色譜條件：Agilent 1200型液相色譜儀；色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（50.0 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為甲醇∶0.1%甲酸水溶液（70∶30），分析時間10 min；柱溫25 ℃；流速0.35 mL/min。質譜條件：AgilentG6220A飛行時間質譜儀；離子化方式為ESI（+）；質量掃描范圍m/z 110～1 000；毛細管電壓4 000 V；霧化氣壓力206 844 Pa；干燥氣流速度10 L/min；干燥溫度350 ℃；碎片電壓180 V；選擇參比液作實時的質量數矯正。

1.6? 克雷伯菌P3發酵條件優化

1.6.1? 克雷伯菌P3生長與產物產量的關系。將克雷伯菌P3的種子液按1%接種量轉接于裝有無機鹽培養基的250 mL三角瓶中，2%果糖誘導，28 ℃、130～140 r/min搖瓶發酵培養，從培養4 h開始，每隔2 h測定發酵液的吸光度。在600 nm處測定克雷伯菌P3的生物量，537 nm處測定靈菌紅素產量，利用比色法取吸光度并繪制靈菌紅素產量與菌體生長曲線。

1.6.2

溫度對克雷伯菌P3生長及產物產量的影響。將克雷伯菌P3的種子液按1%接種量轉接于裝有無機鹽培養基的250 mL三角瓶中，2%果糖誘導，分別于20、24、28、32、36 ℃搖床中發酵培養，在色素生產的最佳點測定其吸光度并記錄。

1.6.3

pH對克雷伯菌P3生長及產物產量的影響。配制pH分別為4.0、6.0、7.2、8.0、10.0的無機鹽培養基，將克雷伯菌P3的種子液按1%接種量轉接于裝有不同pH無機鹽培養基的250 mL三角瓶中，2%果糖誘導，于24 ℃搖床中發酵培養，在色素生產的最佳點測定其吸光度并記錄。

1.6.4

NaCl濃度對克雷伯菌P3生長及產物產量的影響。配制NaCl濃度分別為0、0.05%、0.10%、0.20%的無機鹽培養基，將克雷伯菌P3的種子液按1%接種量轉接于裝有不同NaCl濃度無機鹽培養基的250 mL三角瓶中，2%果糖誘導，于24 ℃搖床中發酵培養，在色素生產的最佳點測定其吸光度并記錄。

1.6.5

糖誘導對克雷伯菌P3生長及產物產量的影響。將克雷伯菌P3的種子液按1%接種量轉接于分裝好的無機鹽培養基中，分別用2%果糖、蔗糖、葡萄糖誘導，于24 ℃搖床中發酵培養，在色素生產的最佳點測定其吸光度并記錄。

1.7? 產物抑菌試驗

采用濾紙片法測定產物的抑菌能力。分別將金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌接種到LB液體培養基中，搖瓶培養24 h，分別取適量菌體均勻涂布到LB固體培養基上；取溶于甲醇溶液與DMSO溶液中的樣品各2 mL，放入滅好菌的濾紙片，充分浸潤后瀝干液體，無菌條件下放置到上述涂布菌株的固體培養基上，甲醇溶液與DMSO溶液作為空白對照，37 ℃培養24 h，觀察有無抑菌圈及測量抑菌圈的大小。

2? 結果與分析

2.1? 菌種鑒定

該菌菌落在LB培養基上呈紅色，規則的圓形，表面濕潤，革蘭氏染色陰性；該菌株16S rDNA基因序列提交至GenBank，登錄號為KF657724；采用NCBI數據庫在線程序BLAST分析，與已知微生物的16S rDNA基因序列比對并結合顯微鑒定結果，確定該菌為一株產酸克雷伯菌。

2.2? 菌種發酵

在發酵0～24 h，發酵液顏色由無色變為紅色；繼續發酵至48 h，顏色逐漸變淺。分析原因可能是作為代謝副產物，色素隨細菌的生長不斷積累，細菌生長至穩定期后，隨著培養基中營養成分的消耗，色素的產量趨于穩定；到達衰退期后，由于培養基中的營養成分消耗殆盡，細菌為了維持自身生存，一方面減少了色素的生產，另一方面可能對色素進行了降解利用。發酵24 h后光照條件下放置4 h，發酵液沒有明顯變化。

2.3? 產物的分離提取與分析鑒定

發酵液24 ℃、150 r/min搖床培養24 h后，離心后取發酵液，分別用乙酸乙酯與丙酮萃取旋蒸至恒重，混合后冷凍干燥得到的粗產物產量為70～90 mg/L。

2.3.1

色素酸堿法定性分析。甲醇溶液中的色素粗品出現了酸性條件下紅色、堿性條件下橙黃色的特征反應。與馮苗等［2］報道的文獻一致，初步判斷該色素中可能含有靈菌紅素。

2.3.2? 色素紫外吸收光譜分析。對該色素粗品的甲醇溶液和DMSO溶液分別進行紫外-可見吸收光譜掃描，發現該色素在甲醇溶液中的特征吸收峰出現在537 nm處，在DMSO溶液中的特征吸收峰出現在480 nm左右。與報道中靈菌紅素在酸性條件下特征吸收峰位于535～540 nm，堿性條件下位于466～480 nm的結果基本一致［11］。推測該色素成分主要為靈菌紅素。

2.3.3

色素LC-MS分析。通過LC-MS分析（圖1）顯示，該色素在二級色譜中形成單一峰，顯示成分較為單一；質譜圖顯示該色素的相對分子量為324.27。通過LC-MS分析，產物可以得到離子碎片為m/z 309、m/z 252和m/z 221等。

2.4? 克雷伯菌P3發酵條件優化

2.4.1? 菌體生長與產物產量的關系。以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制靈菌紅素（PG）產量和菌體生長曲線，如圖2所示，其中OD600代表菌體生長曲線，OD537代表PG產量。從圖2可以看出，克雷伯菌P3發酵所產靈菌紅素產量及生物量均呈現先增加后穩定再下降的趨勢，在20 h達到較高水平，24 h達到高峰，最佳色素生產時間為20 h。

2.4.2

溫度對菌株生長及產物產量的影響。從圖3可以看

出，在20 ℃時，生物量及靈菌紅素產量均較低，隨著溫度升高呈上升趨勢，超過24 ℃時生物量及靈菌紅素產量都開始下降。由此可見，克雷伯菌P3最佳培養溫度為24 ℃。

2.4.3

pH對菌株生長及產物產量的影響。從圖3可以看出，不同pH對靈菌紅素產量與菌體生長有較大影響。pH為4.0時，不產色素，菌體生物量稍有增加；pH為6.0時，克雷

伯菌P3開始生長并產生色素；pH為7.2時生物量和色素生

產達到高峰，pH繼續增大，靈菌紅素產量和生物量都開始下降，生產靈菌紅素最佳pH為7.2～8.0。

2.4.4

NaCl濃度對菌株生長及靈菌紅素產量的影響。從圖3可以看出，克雷伯菌P3在不同NaCl濃度梯度下均可增加生物量并產生靈菌紅素。克雷伯菌P3在NaCl濃度為0時，菌體生物量和靈菌紅素產量相對較低；在NaCl濃度為0.05%時，菌體生物量和靈菌紅素產量都達到較高水平，但NaCl濃度達到0.20%時菌體生物量及靈菌紅素產量都降低。克雷伯菌P3最適宜增加生物量并產生靈菌紅素的NaCl濃度為0.05%～0.10％。

2.4.5

誘導糖類型對菌株生長及靈菌紅素產量的影響。從圖3可以看出，克雷伯菌P3在果糖和蔗糖存在條件下菌體生物量和靈菌紅素產量均較高，但是果糖效果更佳；在葡萄糖誘導下并不產色素。

綜上所述，克雷伯菌P3利用改良的無機鹽培養基發酵培養，NaCl濃度為0.05%～0.10%。發酵條件最終確定為24 ℃培養20 h，pH維持在7.2～8.0，利用2%果糖為誘導糖，發酵結束后萃取蒸餾，冷凍干燥后得到的靈菌紅素粗品產量為90～130 mg/L。

2.5? 抑菌試驗

產物僅在溶于DMSO溶液中時對金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌有抑菌活性，抑菌圈直徑分別為8、7、7 mm。

3? 討論與結論

自靈菌紅素被發現以來，諸多研究人員圍繞靈菌紅素的產生菌的獲取及發酵制備開展了一系列工作。倪亮等［12］經優化后的培養基搖瓶發酵，培養34 h后靈菌紅素產量達到317.23 mg/L；Kavitha等［13］采用響應面法統計模型篩選最佳培養條件，搖瓶培養48 h得到靈菌紅素的濃度為789 mg/L；李穎等［14］通過從土壤中篩選得到一株黏質沙雷菌，利用小型發酵罐進行發酵14 h，靈菌紅素產量最大值可達到1 212.7 mg/L；Cang等［15］以一株可以利用乙醇的S.marcescens S389為出發菌株，搖瓶培養48 h，產量提高到2.95 g/L；Bae等［16］以Serratia sp.KH-95為出發菌株，利用反應器擴大發酵生產靈菌紅素，得到了靈菌紅素產量為13.1 g/L。靈菌紅素的微生物生產通常是通過液體發酵培養，也有一些研究者采用固態發酵培養。例如，De Araújo等［17］通過固體培養基，在28 ℃下發酵S.marcescens獲得了49.5 mg/mL的靈菌紅素產量。

靈菌紅素是一種暗紅色的色素，并隨著溶液體系的酸堿度而變化，在酸性環境下呈現紅色，在堿性或中性環境下呈橙黃色，在酸性環境下會更穩定。靈菌紅素在不同pH條件下呈現特有的吸收波長，酸性條件下在535～540 nm有特征吸收峰，堿性條件下在466～480 nm有特征吸收峰。該試驗對提取物進行波長掃描，在甲醇溶液中的特征吸收峰出現在537 nm處，在DMSO溶液中的特征吸收峰出現在480 nm左右。在LC-MS分析中，色素提取物相對分子質量為324.27，離子碎片為m/z 309、m/z 252和m/z 221等，與Lee等［18］的研究結果基本一致，確定克雷伯菌P3菌株產的紅色素為靈菌紅素。對克雷伯菌P3產靈菌紅素的發酵條件進行優化，確定較優的發酵條件為無機鹽培養基，溫度24 ℃，培養時間20 h，pH為7.2～8.0，2%果糖誘導，NaCl濃度0.05%～0.10%，優化后靈菌紅素產量為90～130 mg/L。對靈菌紅素進行抑菌試驗，發現產物溶于DMSO溶液時對金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌3株菌出現抑菌效果。

該試驗通過改變菌株的培養基與培養條件，使得靈菌紅素的產量得到提高，并初步研究了所得靈菌紅素的抗菌性能，但是對此靈菌紅素的其他功能研究鮮見報道，靈菌紅素的抗癌性能、化妝品領域及食品領域都是現在研究的熱點，該試驗提供了一種生產靈菌紅素的方法，可為以后的研究提供方法及思路。

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