乳桿菌強化發酵對苦蕎酵素抗氧化特性及風味的影響

邊名鴻，袁天萌，楊 南，韓保林, ，黃丹丹，許 強

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.川北醫學院，四川南充 637000；3.南充生物醫藥產業技術研究院，四川南充 637000）

酵素為一種以單種或多種食材為底物，經過微生物發酵而得到的具有一定生理功能的產品[1-2]，其種類繁多，具有預防治療心腦血管疾病、降血糖、提高免疫力的功能[3-4]，部分酵素能提高食用者體內的SOD 酶活以提高其抗氧化功能[5]。酵素原料來源較多，主要集中在植物與果蔬類，其中燕麥、青稞、苦蕎等粗糧作為原料發酵酵素受到諸多學者的關注，如朱雪洋等[6]采用紅曲霉發酵沙棘青稞酵素，得到一款抗氧化活性高、色澤艷麗的粗糧酵素；王霞等[7]以燕麥、青稞等為原料，通過植物乳桿菌發酵后，其DPPH 自由基清除率提高了20%。粗糧中含有大量膳食纖維，其可被乳酸菌分解為小分子活性物質，苦蕎作為人們生活中常見的粗糧，其不僅含有比大米、玉米等主要糧食更多的蛋白質、維生素和微量元素，還富含其他谷類農作物沒有的生物類黃酮及多種抗氧化物質[8]，是良好的酵素生產原料，但此方面的相關研究較少。

乳桿菌是酵素常用的發酵菌種，乳酸發酵可以保持或提高產品整體風味，增加抗氧化物質的含量[9]。李慧等[10]利用植物乳桿菌在內的3 種乳酸菌分別發酵枇杷漿，結果發現植物乳桿菌發酵的枇杷漿具有較好的抗氧化活性。和東芹等[11]利用植物乳酸菌對黃瓜汁進行發酵，得到在該發酵工藝下的酵素總酚含量為發酵前黃瓜汁的1.74 倍。劉倩等[12]通過比較不同菌種發酵對諾麗果酵素品質的影響，得到植物乳桿菌產SOD 酶活的能力更強，具有更高的抗氧化活性。

植物乳桿菌作為酵素發酵菌種時，可以提高酵素整體的抗氧化活性，為探究植物乳桿菌對粗糧酵素的影響，以苦蕎為原料，優選強化發酵菌種并優化強化發酵工藝，探究對抗氧化特性的影響，以期獲得苦蕎酵素強化發酵工作菌株以及發酵工藝參數，提升苦蕎酵素抗氧化能力及感官品質，為苦蕎酵素產品的開發提供數據支持，同時豐富酵素發酵微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎、蔗糖、酵素菌粉 市售；植物乳桿菌（LBS8、MRS5）、副植物乳桿菌（MC6）、副干酪乳桿菌（SL1）保藏于四川輕化工大學生物工程學院實驗室；耐高溫α-淀粉酶、糖化酶 均為分析純，北京奧博星生物科技有限公司；市售酵素菌 北京川秀科技有限公司；水楊酸、沒食子酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、抗壞血酸、DPPH 等 均為分析純，合肥博美生物科技有限公司；福林酚 上海金穗生物科技有限公司。

890N-5975B 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 科技有限公司；SPME 50/30UM DVB/CAR on PDMS 型頂空固相微萃取、手動進樣柄、萃取頭上海安譜科學儀器有限公司；WFZUV-2000 型紫外可見光光度計 美國安捷倫科技公司；DD-4000型離心機 四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎酵素制備工藝

圖1 為苦蕎酵素制備工藝流程。操作要點：打粉時需盡量打碎，以便于糖化過程順利進行。α-淀粉酶添加量為15 U/g，液化溫度控制在50 ℃左右，液化時間為30 min。糖化酶添加量為120 U/g，糖化溫度控制65 ℃左右，在時間為60 min 時，煮沸升溫至100 ℃，將α-淀粉酶和糖化酶滅活。通過單因素和正交試驗選擇最佳工藝進行接種發酵。

圖1 苦蕎酵素制備工藝流程Fig.1 Preparation process of tartary buckwheat Jiaosu

1.2.2 菌種培養 使用自篩乳桿菌和市售酵素菌粉混合發酵，乳桿菌、酵素菌粉分別接種于MRS 肉湯培養基進行活化，于38 ℃培養箱培養48 h 活化好的種子液體備用。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 還原力的測定 參照李世燕等[13]對毛酸漿酵素的測量方法。取經預處理后的發酵液0.2 mL，加入2.5 mL、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，再加入2.5 mL 質量分數10%的鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴20 min 后，流水快速冷卻后加入2.5 mL 質量分數為20%的三氯乙酸，離心機3600 r/min 離心15 min，取上清液2.5 mL 加去離子水2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵，以去離子水作參比在700 nm 下測吸光度。

1.2.3.2 總酚的測定 參考李杰等[14]使用福林酚比色法測定核桃青皮果蔬酵素中總酚含量的方法。在25 mL 比色管中加入稀釋十倍的經預處理的樣液1 mL，加2.5 mL10%福林酚混勻，靜置3 min 后加入1 mL12%碳酸鈉，混勻后定容至25 mL，45 ℃水浴避光顯色30 min，取出后迅速冷卻，696 nm 處測吸光度。

1.2.3.3 總黃酮的測定 參照拐棗中總黃酮的測定方法[15]。取蘆丁標準品，用60%乙醇配制0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，取七支25 mL 比色管，分別加入0、2、3、4、5、6、7 mL 蘆丁標準溶液，分別加入1 mL 5%亞硝酸鈉混勻后靜置6 min，分別加入1 mL 10%硝酸鋁混勻靜置6 min，分別加入10 mL 4%氫氧化鈉后用60%乙醇定容至25 mL，混勻靜置15 min，在510 nm 處測吸光度。

1.2.3.4 SOD 酶活力的測定 參照國標GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》。

1.2.3.5 谷胱甘肽的測定 參考谷胱甘肽的酶法合成條件優化中谷胱甘肽含量測定方法[16]。取TDNB和磷酸二氫鈉制成0.01 mol/L 的DTNB 溶液，棕色瓶低溫保存，取三羥甲基氨基甲烷配制成0.25 mol/L Tris-HCl 溶 液，將0.25mol/L Tris-HCl 溶液以及0.01 mol/L 的DTNB 溶液99：1 體積比混合后得0.1 mmol/L DTNB 分析液，現配現用。用谷胱甘肽標準品配制1 g/L 的谷胱甘肽溶液，分別配制成0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L 的谷胱甘肽溶液。取七只試管，分別加入上述谷胱甘肽溶液0.4 mL，加入1.2 mL 0.15 mol/L 氫氧化鈉混勻，加入3%甲醛0.4 mL 混勻后靜置2 min，取1 mL 加入5 mL DTNB 分析液混勻，靜置5 min。在412 nm 處測定吸光度值。

1.2.4 發酵工藝單因素實驗 選擇發酵溫度、初始糖度、料液比、酵母接種量作為苦蕎酵素的發酵因素，固定發酵溫度23℃、初始糖度20%、初始pH4、酵母接種量0.06%。發酵溫度定為28、30 和32 ℃，初始糖度選擇15°Brix、16°Brix、和17°Brix，酵母接種量設為5%、6%和7%，進行還原力、總酚、總黃酮、SOD 酶活力及谷胱甘肽的測定和感官評定。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素實驗的基礎上設計正交試驗，以溫度、糖度、料液比、接種量為變量，還原力為考查指標，對強化發酵苦蕎酵素制備工藝進行優化，優化水平設計如表1 所示。

表1 發酵工藝優化正交因素水平設計Table 1 Optimization of fermentation process by orthogonal factor level design

1.2.6 風味成分分析

1.2.6.1 GC 條件 柱溫50 ℃維持3 min，以5 ℃/min升溫至270 ℃，運行時間60 min；汽化室溫度250 ℃，載氣為高純度氦氣（99.999%），載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣，溶劑延遲時間1 min。

1.2.6.2 MS 條件 離子源為EI 源，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，倍增器電壓1396 V，溶劑延遲時間2 min，質量掃描范圍29～500。

1.2.6.3 揮發性成分定性方法 采用GC-MS Postmm Analysis 軟件完成，未知化合物采用Wiley 和NIST 譜庫檢索，根據所得譜圖進行匹配分析。與數據庫對比，匹配度＞85%的鑒定結果才予以確認。

1.2.6.4 定量方法 采用面積歸一法，將色譜圖中的共有峰面積值相加作為峰總面積，每個峰面積與總面積之比即為該物質的相對含量。

1.2.7 苦蕎酵素感官品評 由7 名有經驗的酵素品評員組成評定小組，參考QB/T 5323-2018《植物酵素》感官品評標準，對苦蕎酵素色澤、組織形態、滋味、氣味、雜質5 個指標進行單因素的感官評定，要求品評員必須客觀進行評價，品評的時間間隔為5 min?？偡?00 分，具體評定標準如表2，所有指標加權得分即為感官評分。

表2 酵素感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for Jiaosu

1.3 數據處理

數據以平均值±標準差表示，使用SPSS 19.0 進行數據分析，P＜0.05 表示不同菌種發酵差異顯著，Origin 2021 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同乳桿菌對苦蕎酵素活性物質、SOD 酶活力、還原力的影響

SOD 是常用的氧自由基專一清除劑，SOD 活性多用作于評判保健食品的保健功能[5]，由表3 可知，加入了乳桿菌酵素的SOD 酶活與還原力均高于未添加乳桿菌組，其中SL1 的SOD 酶活最高（230.55 U/mL）且顯著高于其他試驗組（P＜0.05），這可能是由于酵素制作中，不同菌種混合發酵對酵素還原力及SOD 酶活都有較大影響[17-18]，其中SL1 發酵苦蕎酵素與丁玉峰等[19]使用乳酸菌發酵葡萄酵素相比，苦蕎酵素的SOD 酶活力為葡萄酵素的7 倍，LBS8 的總還原力與黃酮含量最高，分別為0.741 mg/mL（以VC計）與0.18 mg/mL，顯著高于其他試驗組（P＜0.05）；酵素的顏色、口感和風味受酵素中酚類物質含量影響[17]，MRS5 的總酚含量為2.73 mg/mL 與LBS8 無明顯差異，且兩者均顯著高于其他試驗組（P＜0.05）；加入乳桿菌的谷胱甘肽含量均低于未添加的；還原力是黃酮、酚類物質以及乳桿菌等產生的SOD 等過氧化酶類物質清除氧自由基能力的綜合指標[18]，因此確定植物乳桿菌LBS8 為強化發酵菌種。

表3 不同乳桿菌對苦蕎酵素黃酮、總酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、還原力的影響Table 3 Effects of different lactobacillus on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.2 初始糖度對苦蕎酵素活性物質、SOD 酶活、還原力的影響

不同的發酵糖度會影響發酵體系中pH，進而影響酵素抗氧化物質的含量[20-22]。由表4 可知，在16°Brix 苦蕎酵素的SOD 酶活力為199.41 U/mL，還原力為0.476 mg/mL VC標準溶液，兩者均顯著高于其他試驗組（P＜0.05），糖度過低會導致菌種所能利用的碳源不足，導致發酵速度緩慢，糖度過高可能會抑制微生物的生長，導致SOD 酶活力有所下降[23]；糖度為16°Brix、18°Brix 時總黃酮含量顯著高于初始糖度為12°Brix 的試驗組（P＜0.05）；4 組總酚含量均無明顯差異；谷胱甘肽含量呈現隨糖度先下降后升高的趨勢，12°Brix 與18°Brix 的差異不明顯且顯著高于另外兩個試驗組（P＜0.05）；由還原力確定后續發酵初始糖度為16°Brix 進行優化試驗。

表4 初始糖度對苦蕎酵素黃酮、總酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、還原力的影響Table 4 Effects of initial sugar content on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reducing power of tartary buckwheat Jiaosu

2.3 料液比對苦蕎酵素活性物質、SOD 酶活、還原力的影響

不同的料液配比對酵素的色澤和風味有著直接的影響[24]，由表5 可知，在料液比為1:4 時，所有指標均顯著高于其他試驗組（P＜0.05），但該料液比糊化時易糊鍋，不便操作，綜合成本考慮不選擇該料液比；料液比為1:10 時，除總黃酮和SOD 酶活外，均顯著低于其余試驗組（P＜0.05），考慮是料液比增大使得糖濃度降低，低滲透壓致使發酵受到影響，因此排除該料液比進行后續試驗；料液比為1:6 與1:8 時的總黃酮與谷胱甘肽含量均無顯著差異；料液比1:8 的SOD 酶活力為102.56 U/mL 顯著高于另一組（P＜0.05），兩組還原力無顯著差異，由還原力確定苦蕎酵素后續發酵料液比為1:8 進行優化試驗。

表5 料液比對苦蕎酵素黃酮、總酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、還原力的影響Table 5 Effects of material liquid ratio on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.4 接種量對苦蕎酵素活性物質、SOD 酶活、還原力的影響

在料液比為1:8，糖度16°Brix 時，由表6 可知，整體還原性物質都呈現先升高后下降的趨勢，是因為接種量低時，發酵時間過長，容易導致雜菌污染，而接種量高時會使得發酵過快，營養物質消耗過快，發酵產物轉化率降低[25]，在接種量為6%時總黃酮為0.36 mg/mL，總酚為2.59 mg/mL，谷胱甘肽為0.26 mg/mL，且均顯著高于其余試驗組（P＜0.05），因此確定苦蕎酵素后續試驗接種量為6%進行優化試驗。

表6 接種量對苦蕎酵素黃酮、總酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、還原力的影響Table 6 Effects of inoculation amount on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.5 發酵溫度對苦蕎酵素活性物質、SOD 酶活、還原力的影響

由表7，苦蕎酵素在30 ℃時總黃酮為0.52 mg/mL，均顯著高于其他試驗組（P＜0.05），與全琦等[26]研究結論相符，溫度過高和過低都會對微生物代謝造成影響，導致產品品質降低，適宜的溫度有助于黃酮等活性物質的釋放。SOD 酶活力呈現先升后降的趨勢，在30 ℃時最高為253.89 U/mL 顯著高于其他對照組（P＜0.05），分析原因可能是過高的溫度不適宜微生物代謝導致SOD 酶活降低，還原力在30 ℃達到最高為0.503 mg/mL VC標準溶液，與35 ℃無顯著差異，且兩者顯著高于其他試驗組（P＜0.05），與劉秀娟等[27]混菌發酵蘋果酵素的發酵溫度相近；在35 ℃的總酚含量為3.23 mg/mL 顯著高于其他試驗組（P＜0.05），在30 ℃的谷胱甘肽為0.28 mg/mL 與35 ℃無顯著差異；綜合主要指標還原力與SOD 酶活力確定30 ℃為后續發酵溫度進行優化試驗。

表7 發酵溫度對苦蕎酵素黃酮、總酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、還原力的影響Table 7 Effects of fermentation temperature on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.6 工藝正交試驗優化

通過正交試驗分析溫度、糖度、料液比、接種量對苦蕎酵素還原力和SOD 酶活力的影響，由表8 中極差值分析可知，影響苦蕎酵素還原力的因素主次順序為C＞B＞D＞A，苦蕎酵素中還原力越大越好，其最優工藝是A3B2C1D2，即發酵溫度為32 ℃，糖度16°Brix，料液比1:7，接種量6%，所得酵素中還原力為0.753 mg/mL VC標準溶液。SOD 酶活力為272.12 U/mL，總黃酮含量為0.521 mg/mL，總酚含量為2.75 mg/mL，谷胱甘肽含量為0.273 mg/mL。

表8 苦蕎酵素工藝優化正交試驗結果Table 8 Orthogonal test results for optimizing the fermentation process of tartary buckwheat Jiaosu

2.7 風味物質分析結果

由圖2 和表9 可知，苦蕎酵素中的風味成分主要以醇類和酯類為主，含有少量的酮類、酸類以及其他物質。其中酯類物質以乙酸乙酯為代表，相對含量為5.34%，乙酸乙酯可以為苦蕎酵素提供果香味，是由酵母氨基酸或糖代謝產生的高級醇和乙酰輔酶A 反應形成[28]。其次為亞油酸乙酯，相對含量為4.88%，其有降低血液中膽固醇和血脂的作用，十一酸乙酯具有椰子香氣，可以賦予苦蕎酵素特殊風味。醇類物質含量最高，總相對含量為37.09%，酵素中的醇類化合物主要通過酵母菌等微生物利用糖、蛋白質及氨基酸等物質代謝產生[29]，苦蕎酵素中醇類主要是通過有氧條件下的脫羧反應產生，能增加苦蕎酵素的醇厚感[30]。較郭紅蓮等[31]天然枸杞酵素發酵中醇類物質共檢測出11 種，苦蕎酵素共檢測出20 種，風味物質種類更加豐富。其中甲醇含量較高的原因可能是苦蕎殼中的果膠含量較高，后續工藝優化可在苦蕎殼去除率上進一步研究。孫蕓婭[32]在苦蕎酒甲醇來源研究中發現，苦蕎糖化過程中采用黑曲糖化較黃曲，成品酒的甲醇含量增加了5 倍，因此也可在糖化過程中探究加入不同糖化曲以降低苦蕎酵素中甲醇含量。同時酵素在存放過程中甲醇含量也會下降，因此可對其存放過程中的甲醇含量變化進行研究。酮類物質主要是經過不飽和脂肪酸或氨基酸氧化、降解或是在發酵過程中代謝產生，丁二酮可以為酵素提供特殊的奶油風味。其他類物質中存在著甲苯檢出的情況，而甲苯一般是由外源添加劑或生產過程中接觸到塑料材質等所引起，因此在后續制作中應嚴格控制生產安全。D-天門冬氨酸含量為0.43%，高熳熳等[33]在糙米酵素中也同樣檢測出0.543 mg/mL 的天門冬氨酸，其不僅可以起到鮮味作用，還可以在一定程度上緩解人體疲勞。

表9 苦蕎酵素中揮發性香氣物質檢測結果Table 9 Detection results of volatile aroma substances in tartary buckwheat Jiaosu

圖2 最佳發酵工藝組合的GC-MS 總離子流圖Fig.2 GC-MS Total ion flow diagram of optimum fermentation technology combination

2.8 強化發酵酵素與自然發酵酵素、商品酵素對比分析

由表10 可知，自然發酵與市售酵素菌粉發酵所測總黃酮含量、總多酚含量、谷胱甘肽含量、還原力與SOD 酶活力均低于添加LBS8 植物乳桿菌的強化發酵組，說明苦蕎在經LBS8 強化發酵后能提高其抗氧化能力。

表10 強化發酵與自然發酵、商品酵素發酵對比分析Table 10 Comparative analysis of enhanced fermentation,natural fermentation,and commercial Jiaosu fermentation

3 結論

經工藝優化后，LBS8 植物乳桿菌強化發酵苦蕎酵素的總黃酮含量、谷胱甘肽含量均顯著高于工藝優化前（P＜0.05），通過植物乳桿菌強化發酵以后的苦蕎酵素，其還原力顯著高于市售酵母粉發酵的苦蕎酵素（P＜0.05），說明植物乳桿菌發酵苦蕎有助于苦蕎酵素抗氧化能力的增強。LBS8 作為本試驗4 種乳桿菌中綜合情況最佳的菌株，通過發酵工藝優化后，其發酵所得苦蕎酵素中，揮發性香氣物質豐富，較枸杞酵素所檢測出的醇類物質種類更多，說明苦蕎在風味上也具有更進一步的研究價值。

通過乳桿菌強化發酵苦蕎酵素，較市售酵素菌粉發酵，其抗氧化能力提高了30.73%，除了在抗氧化能力上進行探究外，對苦蕎酵素的其他特征物質還可以進一步改進。本試驗為苦蕎酵素發酵提供了一定的數據支撐，同時也為粗糧酵素開發與利用提供理論依據，后續可以通過將乳桿菌運用到更多的粗糧酵素發酵中，更進一步完善粗糧酵素發酵菌種的選擇以及關鍵工藝的優化。