隆中對酒業中溫大曲真菌類群與理化特性相關性研究

賀子豪，馬佳佳，王俊麟，劉博文，張 瑩，郭 壯，王玉榮,

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創新中心，湖北襄陽 441053；3.湖北隆中對酒業有限公司，湖北襄陽 441053）

作為市場消費較為廣泛的香型，濃香型白酒因綿甜柔順的口感而深受廣大消費者的喜愛，其銷售量約占整個白酒市場的70%[1]。白酒，因香而生，因曲而制，大曲作為白酒釀造的重要原料，在發酵過程中不僅提供代謝和降解谷物原料所需的微生物和酶[2]，亦會產生多種呈香風味物質，例如酯類、醇類、有機酸類、酮類和醛類等[3]。FAN 等[4]對大曲的研究表明，大曲中微生物群系與其理化性質或風味化合物存在顯著相關性；YANG 等[5]采用宏基因組學技術對中溫大曲在自然發酵過程中理化性質、微生物群落和揮發性化合物的動態變化進行了研究，發現大曲的品質可以顯著影響其白酒產品的感官特性，且參與風味物質合成的微生物其代謝作用各不相同。由此可見，大曲的理化特性和風味特性與白酒的品質息息相關，且大曲中微生物群系的生長代謝亦可間接影響白酒的品質。

隨著Illumina MiSeq 高通量測序技術的發展，研究人員利用該項技術對大曲中擁有的微生物類群及其代謝能力進行了更為深入地了解。張清玫等[6]利用高通量測序技術揭示了不同香型中溫大曲中的特征菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、梗霉屬（Lichtheimia）和酵母屬（Saccharomyces），其代謝活動有利于四甲基吡嗪和2,3-丁二醇揮發性風味物質的生成；MA 等[7]利用高通量測序技術揭示了不同產區中溫大曲中主要真菌屬為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和伊薩酵母屬（Issatchenkia），其代謝活動有利于己酸乙酯和壬酸乙酯等揮發性風味物質的生成；DENG 等[8]利用高通量測序技術揭示了四川地區中溫大曲中主要真菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、根霉屬（Rhizopus）和畢赤酵母屬（Pichia），其代謝活動有利于異戊醛、苯甲醛、2-n-淀粉呋喃、丙基壬基內酯和苯乙醛等揮發性風味物質的生成。由此可見，中溫大曲中含有豐富的真菌類群，且因釀造工藝和地域環境的不同，其真菌群落結構及代謝風味物質亦呈現出不同的差異。因此，積極探索不同來源中溫大曲的真菌類群是極為必要的。

襄陽市位于湖北省西北部，居于漢水中游，既有滔滔漢水流經，又有干冷、暖濕空氣交綏，屬北亞熱帶季風氣候。目前研究人員針對該地區中溫大曲的研究多集中在對其微生物類群的解析，而在微生物類群與理化特性和感官特性的相關性方面研究尚少。本研究以該地區湖北隆中對酒業有限公司中溫大曲為研究對象，采用MiSeq 高通量測序技術和傳統純培養技術對大曲中真菌群落結構進行解析的同時，借用電子鼻和常規檢測方法對其風味品質和理化特性進行了評價，并進一步對真菌類群與風味品質的相關性進行了分析，以期為襄陽地區中溫大曲品質的提升和后續工業化生產提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中溫大曲 采集自湖北省襄陽市湖北隆中對酒業有限公司釀造車間的同一批次成品曲庫，隨機抽取樣品共10 份，編號分別為LZZW1～LZZW10，返回實驗室后及時粉碎后一式三份：一份暫存于4 ℃用于微生物的分離鑒定，其余兩份份存于-20 ℃下用于測序、理化和感官指標及留樣；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）北京奧博星生物技術有限責任公司；引物ITS3F/ITS4R、ITS1/ITS4和M13F（-47）/M13R（-48）均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；克隆載體pMD18-T 大連寶生物工程有限公司；DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒 德國Qiagen 公司；5×TransStartTMFastPfuBuffer、dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司。

2500Y 高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；PEN3+EDU3 電子鼻 德國Airsense公司；AND 日本MS-70 快速水分測定儀 上海右一儀器有限公司；AW-1 水分活度儀 無錫碧波電子設備廠；K1100 全自動凱式定氮儀 山東海能科學儀器有限公司；LRH-70 生化恒溫培養箱 上海力辰儀器科技有限公司；Veriti FAST PCR 儀 美國ABI 公司；DYY-12 電泳儀 北京六一儀器廠；UVPCDS 8000 凝膠成像分析系統 美國ProteinSimple 公司；Illunima MiSeq PE300 高通量測序平臺 美國Illumina 公司；R930 機架式服務器 美國DELL 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中溫大曲理化指標的測定 根據行業標準《QB/T 4257-2011 釀酒大曲通用分析方法》規定的方法測定大曲的酸度、氨基酸態氮、淀粉含量、糖化力、酯化力、發酵力、液化力和酒化力；使用快速水分測定儀測定大曲的水分含量[9]；使用水分活度儀測定大曲的水分活度；使用全自動凱式定氮儀測定大曲中蛋白質含量[10]。每項指標均重復測定三次再求取平均值，以確保數據結果的準確性。

1.2.2 中溫大曲風味品質的評價 準確稱取15 g 大曲樣品于電子鼻專用樣品瓶中，室溫狀態下放置30 min，參照劉芳等[11]的測定方法對電子鼻參數進行設置，數據處理時選取已達到平穩狀態的49、50 和51 s 三個時間點傳感器響應值的平均值作為測試值。

1.2.3 基于高通量測序中溫大曲真菌多樣性分析使用試劑盒從中溫大曲中提取微生物宏基因組DNA，參照陳怡等[12]的方法，使用引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC -3'和ITS 4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'）對真菌ITS區域進行PCR 擴增，將檢測合格的擴增產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量雙端測序。

參照WANG 等[13]的方法對測序生成的雙端序列進行合并與質控，利用QIIME（v1.9.1）分析平臺對保留序列進行PyNAST 校準與對齊；UCLUST 聚類并劃分分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）；ChimeraSlayer 剔除嵌合體；與RDP、Greengenes 和SILVA 數據庫比對明確各分類學地位[14]。

1.2.4 酵母菌的分離鑒定 采用倍比稀釋涂布法對中溫大曲中疑似酵母菌進行初分離，28 ℃培養3 d，繼而對具有典型酵母菌形態特征的單菌落進行三次劃線純化并備份菌落形態，經革蘭氏染色后鏡檢并保存顯微鏡形態，最后將菌株進行30%甘油保藏[15]。使用消解酶-氯化芐法對分離株進行DNA 提取，并參照趙慧君等[16]的方法對合格的DNA 產物進行后續ITS 區的擴增、清潔、連接、轉化和測序，將返回的序列去引物后上傳至NCBI 網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST 比對，并下載標準菌株序列與測定的序列一起進行系統發育樹的構建，進而明確各菌株分類學地位。

1.3 數據處理

使用GraphPad Prism 9 軟件繪制中溫大曲各理化指標的小提琴圖；使用Origin 2017 軟件繪制真菌門屬群落結構的堆積條形圖；使用R 軟件繪制優勢真菌屬與各理化指標的冗余分析（RDA）圖；使用Cytoscape 軟件（v3.7.2）繪制優勢真菌屬與理化指標的相關性網絡圖；使用MEGA 7.0 軟件構建分離株系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 中溫大曲理化特征和風味品質的分析

理化性質的測定可映射大曲發酵時的狀態和發酵后的質量，電子鼻技術的使用可對大曲所揮發的不同氣體進行定性識別和定量檢測[17]。本研究首先對中溫大曲各理化指標進行了測定，結果如表1 所示。

表1 中溫大曲各理化指標分析Table 1 Analysis of physicochemical indexes of mediumtemperature Daqu

由表1 可知，納入本研究的10 份中溫大曲中其酯化力平均值為643.86 mg/50 g·7 d，標準差為153.28，其糖化力平均值為729.78 mg/g·h，標準差為111.30。這兩項理化指標在樣品中數值波動較大，且與其余8 個理化指標標準差相比明顯偏高，推測其原因，這可能與大曲擺放的空間位置和儲存的周圍環境有關[18]。除此之外，經數據核驗，所有中溫大曲樣品其各理化指標均符合QB/T 4259-2011《濃香大曲》要求。尉嘉眙等[19]對不同工藝類型大曲的理化指標與釀造所得酒樣風味的相關性進行分析發現，大曲的酯化力與β-苯乙醇和乙醛呈顯著負相關（P＜0.05）；而大曲的糖化力與霉菌數量呈正相關[20]，可見大曲理化指標的測定結果間接反映了真菌類群的豐度與代謝[21]。電子鼻中傳感器W1S、W5S 和W6S 主要用于評價空氣中揮發性風味物質含量[22]，因而進行了屏蔽。本研究進一步對大曲樣品的風味品質進行了評價，其小提琴圖見圖1。

圖1 中溫大曲風味品質評價Fig.1 Analysis of flavor quality of medium-temperature Daqu

由圖1 可知，僅有傳感器W1W（對有機硫化物、萜類物質靈敏）和W2S（對乙醇靈敏）對10 份中溫大曲的平均響應強度大于4，可見隆中對酒業中溫大曲的揮發性物質主要體現在有機硫化物、萜類物質和乙醇上。此外，本研究樣本中W1W 傳感器響應值的平均值大于10，變異系數為8.98%，說明納入本研究的中溫大曲在風味指標上的差異主要表現在有機硫化物和萜類物質上。

2.2 中溫大曲真菌多樣性分析

基于MiSeq 高通量測序技術，本研究對各中溫大曲的測序結果和α多樣性指數進行了分析，結果如表2 所示。

表2 不同中溫大曲的真菌α 多樣性統計分析Table 2 Statistical analysis of fungal α diversity of different medium-temperature Daqu

由表2 可知，納入本研究的中溫大曲共產生624715 條優質真菌ITS 序列，每份樣品平均62472條，去除嵌合體OTU 后，共得到8004 個OTU。當測序深度達到56010 時，樣品LZZW10 的超1 指數和發現物種數最高，分別為1425 和805；樣品LZZW5 的香農指數和辛普森指數最高，分別為3.53 和0.73，由此可見，樣品LZZW10 的真菌物種豐富度最高，LZZW5 的真菌群落多樣性最高。

本研究進一步在門和屬水平上對大曲真菌群落結構進行了解析，其中將平均相對含量＞1.0%的真菌門和屬定義為優勢真菌門和屬，其堆積條形圖如圖2所示。

圖2 基于門（A）和屬（B）水平平均相對含量＞1.0%的真菌群落結構分析Fig.2 Analysis of fungal community structure with average relative abundance of ＞1.0% based on the phylum (A)and genus (B) levels

由圖2A 可知，中溫大曲中存在2 個優勢真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota），其平均相對含量分別為89.11%和10.70%；由圖2B 可知，中溫大曲中存在7 個優勢真菌屬，分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、根霉屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）、曲霉屬（Aspergillus）、畢赤酵母屬（Pichia）、絲孢畢赤酵母屬（Hyphopichia）和青霉屬（Penicillium），其平均相對含量分別為72.36%、10.18%、6.00%、4.22%、1.54%、1.44%和1.08%，這與LIU 等[23]對河南鄭州地區中溫大曲的真菌類群研究結果存在一定的相似性。

2.3 酵母菌菌株的分離鑒定分析

本研究進一步采用傳統純培養技術對中溫大曲中的可培養酵母菌進行了分離，其中具有代表性的2 株酵母菌分離株其菌落形態和顯微鏡形態如圖3所示。

圖3 部分分離株的菌落形態和顯微鏡形態Fig.3 Colony morphology and microscopic morphology of some isolates

由圖3 可知，部分菌株的菌落形態表面粗糙呈毛狀，邊緣為鋸齒形，中間有白色突起，大菌落，顏色為不透明的白色，細胞在電子顯微鏡下呈橢圓狀；另一部分菌株的菌落形態為圓形，表面光滑隆起，邊緣規整，小菌落，顏色為不透明的白色，在顯微鏡下亦呈橢圓狀。本研究進一步對分離得到的酵母菌分離株其基因序列進行系統發育樹的構建，結果如圖4所示。

圖4 分離株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolates

由圖4 可知，分離到的25 株酵母菌菌株共聚為兩大支，其中有14 株酵母菌菌株聚為一支被鑒定為Saccharomycopsis fibuligera（扣囊復膜孢酵母），占總分離株的56.0%；另有11 株聚為另一支被鑒定為Wickerhamomyces anomalus（異常威克漢姆酵母），占總分離株的44.0%。

2.4 中溫大曲真菌類群與理化指標及風味品質的關聯分析

通過上述分析發現，理化因子數值的波動會使得中溫大曲的品質和風味產生一定的差異，真菌類群的生長代謝活動亦會對大曲的風味品質造成一定的影響。為進一步探索真菌類群、理化特性和風味品質之間的聯系，本研究采用RDA 和相關性網絡圖對三者之間的關聯性進行了可視化分析，結果如圖5所示。

由圖5A 可知，RDA1 和RDA2 的累計方差貢獻率為79.46%，樣品LZZW5 與其他樣品之間呈離散狀態，而糖化力、水分含量、淀粉含量、發酵力、蛋白質含量、酯化力和W1S 等指標與其他9 份樣品之間的相關性較強。由圖5B 可知，Thermomyces與酸度呈極顯著負相關（P＜0.01）；Pichia與W2S 傳感器響應值呈顯著正相關（P＜0.05）；Penicillium與發酵力呈顯著負相關（P＜0.05）；Hyphopichia與W5C 傳感器響應值呈顯著正相關（P＜0.05）。

3 討論與結論

“曲乃酒之骨”，大曲的理化特性和風味特性在一定程度上可影響白酒的品質。本研究通過對隆中對酒業中溫大曲理化特性的測定結果進行分析，發現大曲在糖化力和酯化力指標上數值波動比較大。有研究指出，由于大曲中Rhizopus和Aspergillus等霉菌通過分泌水解酶來轉化原料，因而其糖化力會顯著影響風味化合物的代謝[24]。高蛋白酶活性可以促進發酵過程中原料中的蛋白質轉化為氨基酸，進而形成提供風味化合物的α-酮酸和糠醛等化合物[25]。因而本研究進一步對大曲揮發性風味物質進行了測定，結果發現大曲揮發性風味物質主要體現在有機硫化物和萜類物質上，且通過SONG 等[26]的研究發現，有機硫化物2-甲基-3-呋喃硫醇和2-糠基硫醇對濃香型白酒的香氣特征具有一定的貢獻。

MiSeq 高通量測序結果顯示隆中對酒業中溫大曲中蘊含多種真菌類群，其優勢真菌屬分別為Thermomyces、Rhizopus、Dipodascus、Aspergillus、Pichia、Hyphopichia和Penicillium，且基于傳培養技術發現S.fibuligera和W.anomalus為大曲中可培養的優勢酵母菌。中溫大曲在發酵過程中其培養溫度一般控制在50～60 ℃，隨著大曲發酵溫度的升高，嗜熱真菌類群逐漸成為優勢真菌[27]，ZHOU 等[28]的研究發現，Thermomyces在大曲發酵過程中會產生木聚糖酶和蛋白酶等酶類來降解原料中的糖類和蛋白質；Rhizopus、Aspergillus和Penicillium等霉菌屬亦可分泌淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等從而對曲塊原料中的大分子物質進行降解[29]，這為大曲發酵后期其他微生物的生長繁殖提供了充足的營養物質。值得一提的是，Penicillium在各樣品中分布明顯不均，且在樣品LLZW7 和LLZW10 中均未檢測到該菌屬的存在。有研究指出，Pichia和Hyphopichia等酵母菌屬為白酒發酵過程中的重要功能微生物，在生長代謝過程中可與其他微生物相互作用產生乙酸乙酯和4-羥基-2-丁酮等風味物質[30]；Dipodascus在白酒釀造過程對酸類和醇類化合物具有較強的酯化能力[31]，有利于促進白酒酒體風格的形成。亦有研究指出，S.fibuligera和W.anomalus均為大曲中的優勢酵母菌株，不僅能夠產淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡萄糖苷酶等降解原料中的生物大分子進行發酵，還可產香產酯，促進白酒呈香風味物質的形成[32]。

相關性研究進一步證實了微生物在大曲中對其理化特性和風味特性的積極作用。相關性研究發現，Pichia、Hyphopichia和Aspergillus與有機硫化物和芳香類物質的生成存在顯著相關性。有研究指出，霉菌屬和酵母屬被認為是有功能的微生物群，負責形成一系列水解酶、酒精發酵的底物和風味化合物，對于白酒風味品質的提升具有積極影響[33]。然而，在風味品質方面，本研究僅使用電子鼻仿生設備對其揮發性風味物質進行了測定，有研究指出，電子鼻檢測到的不是樣品中具體氣味成分的組成和含量，而是其多種混合氣味成分的綜合信息[34]，因而導致了本研究中大曲真菌類群與風味成分之間相關性較為模糊。因此，在后續相關研究中應進一步擴大對中溫大曲樣品的采集數量，并進一步結合宏基因組學、感官和色譜分析探究真菌類群對大曲風味品質的影響，以深入揭示中溫大曲中微生物生長代謝與濃香型白酒品質之間的潛在聯系，為濃香型白酒品質的提升提供數據支撐。