桑葚發酵前后酚類組成變化及其抗氧化活性分析

韓曉云，陶雨婷，戰佳瑩，李俊宏，杜寶昌，陳 婧，孫慶申,

（1.黑龍江大學生命科學學院，農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；2.甘南林場，黑龍江齊齊哈爾 162100；3.河北環境工程學院，河北農業生態安全重點實驗室，河北秦皇島 066102）

桑葚是一種營養價值極高的藥食同源植物，被稱為“民間圣果”[1]，具有抗氧化[2]、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效[3]，是21 世紀的最佳保健果品之一[4]。這些功能源于桑葚中的各種功能成分，如酚類化合物、多糖、有機酸、維生素等[5]。作為其中主要的活性物質之一，酚類能夠參與植物生長發育、基因表達和信號傳導，同時在一定程度上影響植物源食品的感官品質[6]。此外，酚類物質還具有抗氧化、抑菌、抗炎、降血糖等多種活性[7]。桑葚能抑制自由基對人體的損傷，并促進人體產生抗氧化應激反應[8]。而在桑葚抗氧化性能中酚類物質起決定性作用，主要包括酚酸、類黃酮、花色苷等[6,8]。

目前，對酚類物質的提取多集中于通過有機溶劑浸提和超聲波輔助法，再考察溫度、pH 和光照對其穩定性的影響[9-10]，而對于結構和組成鑒定較少，高效液相色譜與質譜聯用法（LC-MS）可快速分析酚類物質組成[11]，有助于深入研究其特征成分與抗氧化活性之間的關聯[12]。

桑葚發酵是微生物代謝的過程，酵母菌將糖轉化為醇類、酯類以及其它代謝物，乳酸菌將產生酸類和酶，這些代謝物對桑葚飲料的感官品質有很大的影響[13-14]，同時還能提高功能活性。孫白虎[13]研究乳酸菌發酵桑葚汁的抗氧化能力時發現，發酵能提高酚類物質的含量，并提高抗氧化能力。在過去的幾十年里，轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學技術已經被應用許多研究領域中[15]。利用代謝組學技術為差異代謝物的代謝途徑和目標活性物質的研究提供了新的思路[16]。本研究旨在探究桑葚發酵前后酚類的抗氧化性能，利用非靶向代謝組學分析找到桑葚發酵前后酚類的差異代謝物，探究其組成變化及涉及的主要代謝通路，進而探索通過發酵技術對桑葚酚類代謝途徑中代謝物的影響，為桑葚產品開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣甘南林場提供的龍桑一號（Morus ablaL.cv.Longsang 1）；從桑葚酵素體系中分離得到酵母菌與乳酸菌 黑龍江大學生物工程專業實驗室提供，經生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定為畢赤酵母菌（Pichia kudriavzevii，保藏號CGMCC 22027）和融合魏斯氏乳酸菌（Weissella confusa，保藏號CGMCC 22028）；氯化鉀、乙酸鈉、抗壞血酸、無水乙醇 分析純，中國天津市科密歐化學試劑有限公司；大孔樹脂AB-8 非極性，中國天津市光復科技發展有限公司；乙腈 色譜純，美國賽默飛世爾科技公司；甲酸、甲酸銨 色譜純，中國江蘇默克生命科學有限公司。

SB-5200DT 超聲清洗儀 中國寧波新藝超聲設備有限公司；Vanquish 超高效液相系統 美國Thermo Fisher Scientific 公司；Q Exactive Focus 質譜檢測器 配有電噴霧離子源（ESI）及Proteowizard 數據處理系統，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Biofuge 22R 高速冷凍離心機 美國Beckman 公司；HB-10 旋轉蒸發儀 德國IKA。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚發酵飲料制備 桑葚飲料按照本課題組前期優化方案制備[17]，桑葚（Morus ablaL.cv.Longsang 1）解凍洗凈，在100 mL 純凈水中添加30 g 桑葚和10 g 糖配制成桑葚飲料，榨汁混合后進行滅菌（80 ℃ 15 min）。將活化后的畢赤酵母菌（Pichia kudriavzevii）以8%接種量接種到桑葚飲料中，在30 ℃下發酵29 h 后，再將融合魏斯式乳酸菌（Weissella confusa）以4%接種量接種繼續發酵29.5 h，以未接菌的桑葚飲料為對照，發酵結束后過濾、巴氏滅菌，將其在4 ℃下保藏。設定發酵前桑葚飲料對照組（UF），發酵后桑葚飲料組（PW）進行以下分析。

1.2.2 酚類物質提取純化 將50 g 桑葚飲料置于燒杯中，按1:6 的料液比加入80%的乙醇溶液，40 ℃超聲40 min，6000 r/min 離心15 min，將上清液在45 ℃旋轉蒸發后冷凍干燥，得到酚類粗提物。再利用AB-8 大孔樹脂純化，設置粗提物的上樣濃度為1 mg/mL、洗脫液為pH3 的60%乙醇，洗脫流速為1 mL/min，收集洗脫液經45 ℃旋轉蒸發后冷凍干燥，參照Wang 等[18]的方法，測得最后多酚含量為634.14±12.92 mg/g，用作后續實驗。

1.2.3 酚類抗氧化能力測定 設置酚類和VC溶液濃度分別是0.01、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL，參考GBT 39100-2020 對DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力進行測定，參考文獻進行酚類OH 自由基清除能力[19]、總還原能力測定[20]。

1.2.4 酚類物質組成分析

1.2.4.1 高效液相色譜與質譜聯用樣品前處理 參照劉瑩[21]的方法，取適量酚類物質于2 mL 離心管中；加入400 μL 甲醇溶液（-20 ℃保存），渦旋混合1 min；13400×g 4 ℃離心10 min，取全部上清液，轉移至新的2 mL 離心管中，濃縮干燥；準確加入150 μL 80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸（0.0004%）溶液（4 ℃保存）復溶樣品，取上清液用0.22 μm 膜過濾，濾液轉入到檢測瓶中，待用。

1.2.4.2 高效液相色譜與質譜聯用分析條件 參照劉瑩[21]的方法，色譜條件：采用ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫為40 ℃，進樣量2 μL，流速為0.25 mL/min。正離子模式：流動相為0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脫程序為：0～1 min，2% C；1～9 min，2%～50% C；9～12 min，50%～98% C；12～13.5 min，98% C；13.5～14 min，98%～2% C；14～20 min，2%C。負離子模式：流動相為乙腈（A）和5 mol/L 甲酸銨水（B），梯度洗脫程序為：0～1 min，2% A；1～9 min，2%～50% A；9～12 min，50%～98% A；12～13.5 min，98% A；13.5～14 min，98%～2% A；14～17 min，2%A。質譜條件：利用電噴霧離子源（ESI），在正負離子模式下分別采集數據。正負離子噴霧電壓分別為3.50 和-2.50 kV，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率70000 進行一級全掃描，一級離子掃描范圍m/z 81～1000，并采用HCD 進行二級裂解，碰撞電壓為30%，二級分辨率為17500，采集信號前3 離子進行碎裂，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS 信息。將分子離子進行碎裂，檢測獲得的分子離子碎片信息進行定性分析。

1.3 數據處理

利用Origin 2018 版軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。LC-MS 數據通過Proteowizard 軟件包（v3.0.8789）中MS Convert 工具將原始質譜下機文件轉換為mzXML 文件格式，采用R XCMS 軟件包對數據進行處理。通過Simca 軟件將所得代謝物峰面積數據進行PCA 分析，將二級質譜數據結合BioDeepDB、mzCloud 在線數據庫比對酚類物質的質核比和保留時間進行鑒定分析。將酚類差異代謝物結合KEGG 數據庫進行相關代謝通路分析。通過微生信平臺將酚類差異物質的峰面積及四種抗氧化指標進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 酚類物質抗氧化能力分析

在發酵過程中，由于微生物水解作用會影響桑葚發酵飲料的抗氧化活性，因此利用多種方法同時評價其抗氧化能力（圖1）。

圖1 酚類物質的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of phenolic substances

自由基是指含有未配對電子的游離分子和離子，其在生物體內參與氧化還原反應，對機體產生氧化損傷[22]。在酚類物質的抗氧化能力研究中，大多數都體現出對自由基的清除能力和總還原力[23-24]。其中清除自由基的能力是由于缺乏自由基電子，使自由基與酚羥基反應，形成更穩定的自由基半醌結構，從而減少自由基的氧化[25]。本研究中發酵前后酚類物質均對DPPH、OH、ABTS+自由基存在一定清除作用，且抗氧化能力均隨濃度的增大呈上升趨勢。當酚類物質濃度為1 mg/mL 時，UF 的DPPH 自由基清除率為45.97%±2.23%，PW 的清除率為59.01%±3.59%；OH 自由基清除率UF 為68.68%±1.23%，PW 為78.55%±0.57%，ABTS+自由基清除率UF 為87.55%±0.87%，PW 為87.56%±0.33%，VC為91.31%±1.19%。發酵后較發酵前飲料的酚類物質對DPPH自由基和OH 自由基清除率顯著增高（P＜0.05），ABTS+自由基清除率與VC相似。總還原能力中發酵后酚類物質抗氧化能力與VC更接近。范金波等[26]研究發現，藍莓與黑加侖中1 mg/mL 多酚物質對DPPH 自由基清除率低于10%，而桑葚中1 mg/mL多酚物質對OH 自由基清除率低于20%，該結果低于本實驗中同一濃度下酚類物質的抗氧化性能指標，表明該實驗中提取的酚類物質抗氧化活性更強。

2.2 主成分分析（PCA）

為了將不同組別在代謝物積累上的差異辨別出來，采用主成分分析方法（PCA）對樣品進行分類，便于掌握發酵桑葚前后酚類物質代謝物的整體情況。以樣品在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）形成的平面上投影得分值為空間坐標，可以直接地反映樣品間的相似性。

由圖2 可知，發酵前后的酚類物質平行樣比較集中，證明組內差異較小，具有良好的穩定性和重復性。而PW 與UF 間得到了明顯的分離。PC1 和PC2總貢獻率為66.98%。該模型的交叉驗證主要參考R2X 等參數，R2X 是模型的可解釋度，R2X=0.671，大于0.5 證明模型較好。結果表明，不同組別間的代謝物差異較大，可以有效分離，該結果能用來研究發酵前后桑葚酚類的代謝物差異。

圖2 未發酵桑葚飲料（UF）和發酵后桑葚飲料（PW）酚類物質主成分分析Fig.2 Principal component analysis of phenolic substances in unfermented mulberry beverage (UF) and fermented mulberry beverage (PW)

2.3 發酵前后桑葚酚類差異代謝物篩選及分析

P值作為判定發酵前后酚類物質差異代謝物的重要指標，將t檢驗的P＜0.05 的代謝物作為篩選標準，得到酚類差異代謝物鑒定分析結果如表1 所示。本實驗比較發酵前后桑葚酚類物質，共鑒定出46 種差異代謝物，包括3 種花色苷類、10 種酚酸類、18 種黃酮類、15 種其它酚類物質，其中26 種上調，20 種下調。

表1 差異代謝物定性分析結果Table 1 Qualitative analysis of differential metabolites

發酵后較發酵前上調花色苷2 種、酚酸5 種、類黃酮11 種、其它酚類8 種；下調花色苷1 種、酚酸5 種、類黃酮7 種、其它酚類7 種。由上述對比可知，桑葚發酵后上調花色苷、類黃酮及其它酚類物質個數較下調多，進而證實發酵過程中豐富了酚類物質，提高生物活性能力。將發酵前與發酵后酚類物質中上調和下調的峰面積分別相加，可得發酵后總花色苷減少，類黃酮、酚酸及其它酚類物質增加。發酵后顯著上調的包括：矢車菊素3-（6-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷）、矢車菊素3-（6-咖啡酰基）、香草扁桃酸、反式阿魏酸、芹菜素4'-O-葡萄糖、圣草酚、芥子醇、3-羥基苯甲醛和1-萘酚等；下調的包括：3-羥基苯甲酸、槲皮素4'，7-二葡糖苷和楊梅素等酚類物質。Kwaw 等[27]通過植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌發酵桑葚，采用LC-MS 鑒定其中酚類物質，共有3 種花色苷、5 種類黃酮和11 種酚酸物質，該結果較本實驗鑒定酚類物質數量較少，說明本實驗所用桑葚中酚類物質更豐富。

2.4 酚類差異代謝物的代謝通路分析

代謝通路分析是闡明不同樣品之間代謝變化機制的重要工具。基于KEGG 數據庫，分析了酚類物質所參與的代謝途徑。在整個發酵中共鑒定了4 個相關代謝通路，分別是植物次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類生物合成、類黃酮生物合成、花色苷生物合成。以植物中酚類相關代謝途徑為指導，參考有關文獻并結合上述代謝物及代謝通路，繪制桑葚飲料中酚類物質代謝途徑如圖3[28-32]。結果表明，經發酵后的桑葚飲料通過植物次生代謝產物的生物合成途徑下調了沒食子酸的表達量，生成反式肉桂酸，經苯丙烷類生物合成途徑上調反式阿魏酸、芥子酸和芥子醇的表達量，以提高酚酸類物質的含量。同時經過類黃酮生物合成途徑上調圣草酚和木犀草堿等類黃酮類物質，進一步通過花色苷合成途徑上調矢車菊素的衍生物。

圖3 酚類相關代謝途徑Fig.3 Anthocyanin metabolic pathways

2.5 酚類差異代謝物與抗氧化能力相關性分析

桑葚的抗氧化能力被認為與其具有抗氧化功能的活性物質有關，如花色苷、酚酸、類黃酮等多酚類物質。因此，將發酵前后桑葚酚類差異代謝物含量與抗氧化能力之間進行相關性分析（表2）。結果表明，其中與DPPH 和OH 自由基清除率呈正相關的均有27 種，占總酚類物質的58.70%；與ABTS+自由基清除率呈正相關的共有11 種，占總酚類物質的23.91%，與還原力呈正相關的有20 種，占總酚類物質的43.48%。因此推斷58.70%、58.70%、23.91%和43.48%的酚類物質依次對DPPH、OH、ABTS+自由基清除能力及還原力具有貢獻作用。其中芥子堿與DPPH 自由基清除能力相關系數最高；矢車菊素3-O-（6-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷）與OH 自由基清除能力正相關系數最高；N-阿魏酰基-1,4-丁二胺與還原力相關系數最高；生物素A 對ABTS+自由基清除能力正相關系數最高。將所得數據進行統計學分析，發現發酵后酚類物質對DPPH 自由基、OH 自由基、還原力與發酵前具有差異極顯著分別有12 個、38 個和37 個，而對ABTS+的作用中發酵前后酚類物質均差異不顯著（P＞0.05），這表明發酵前后酚類物質的組成變化將會影響不同的抗氧化能力指標。通過比較四大類酚類物質中與四種抗氧化指標呈正相關的個數占該大類中總個數的百分比，結果可得四種酚類物質對抗氧化活性貢獻率的大小順序是花色苷＞類黃酮＞其它＞酚酸。

將酚類差異物質和抗氧化能力之間相關性與上述發酵前后酚類物質含量變化進行結合分析，結果表明經發酵后的上調的酚類物質與DPPH 和OH 自由基清除能力之間呈正相關，與還原力呈負相關，且與ABTS+自由基清除能力相關性不明顯。

3 討論與結論

已有研究發現，在玫瑰果酒發酵期間，酚類化合物，特別是黃酮苷、異黃酮類、黃酮醇和花色苷等是鑒定出最豐富的差異代謝物，這些物質對果酒的品質起主要作用[33]。本研究以發酵前后桑葚酚類物質為研究對象，選擇了與酚類相關的次生代謝物進行代謝組學分析，結果表明，從中共篩選出酚類差異代謝物共有46 種，包括花色苷、類黃酮、酚酸類及其它酚類物質。

短時間的發酵會使酚類物質增加，這是因為高濃度的糖促進了酚類在發酵液中的溶解，以及酵母發酵過程產生的有機酸與酚類反應，產生酚酸類化合物，這些酚酸在不斷地聚合，并在氧化反應過程中與花色苷及酒石酸結合，進而生成對羥基類肉桂酸和酚類[33]。本實驗中酚類物質經過發酵后含量增加，證實了上述結果。

有研究表明蜂蜜中含有15 種常見酚類，包括沒食子酸、白楊素和綠原酸等，具有較好的DPPH 自由基清除能力[34]。邵郅勝等[20]研究歐李葉片不同生長階段中酚類含量與抗氧化性時發現，酚類主要包括總酚、總黃酮、原花青素、花色苷等，且酚類物質含量與抗氧化活性之間存在協同關系，抗氧化活性隨多酚含量增加而提高。本研究結果表明發酵后酚類物質含量增加，且抗氧化性能增加，這與上述研究結果一致。

酚類的生物合成是植物次生代謝中的重要分支，雖然不同物種中酚類的種類和含量不同，但基本合成途徑相似且已基本清楚[35]。已有研究表明，基于非靶向代謝組學技術比較發酵前后果蔬酚類的組成變化，發現乳酸菌發酵影響了酚類物質的組成[36]。本研究結合KEGG 數據庫和代謝組學結果，證明發酵前后酚類組成變化存在差異，而這種差異源于發酵菌種對于桑葚飲料的介導作用，進而提高抗氧化能力。因本實驗通過LC-MS 技術進行酚類提取物測定，因此在二級質譜數據中還含有氨基酸及有機酸。結合微生物代謝途徑可知，經發酵后總氨基酸與有機酸的含量下降，這是因為氨基酸一部分為菌株提供氮源，另一部分代謝成有機酸，而有機酸可以經過三羧酸循環等代謝途徑徹底被氧化生成CO2和H2O，同時為發酵過程中的菌株提供能量。該結果將為通過發酵技術提高桑葚飲料酚類物質的抗氧化能力提供理論支持。而本實驗中選用的兩株菌均是來自于桑葚酵素體系中篩選得到的，下一步將研究桑葚飲料發酵后酚類物質在體內抗氧化功能的變化及機制。

綜上，發酵前后桑葚酚類差異代謝物共有4 大類46 種，包括3 種花色苷類、10 種酚酸類、18 種類黃酮及15 種其它酚類。發酵后花色苷類含量下降，而酚酸、類黃酮和其它酚類含量均有所提高。酚類主要涉及4 個代謝途徑，包括植物次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類生物合成、類黃酮生物合成和花色苷生物合成。發酵前后桑葚酚類均對DPPH、OH、ABTS+自由基有顯著清除能力，同時有一定的還原力，且PW 的4 種抗氧化能力指標均高于UF。酚類差異代謝物中芥子堿、矢車菊素3-O-（6-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷）、生物素A 和N-阿魏酰基-1,4-丁二胺依次與DPPH、OH、ABTS+的自由基清除能力和還原力的正相關系數最大。