信陽(yáng)綠茶中糖蛋白和茶黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

基金項(xiàng)目：2022年度鄭州工程技術(shù)學(xué)院技術(shù)研發(fā)推廣與轉(zhuǎn)化基金（zjz202202）；2018年度鄭州工程技術(shù)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育基金（CXTD2018K3）；2024年度鄭州工程技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（鄭工教［2024］4號(hào)）

通信作者簡(jiǎn)介：宋彥顯（1979—），女，河南南陽(yáng)人，碩士，鄭州工程技術(shù)學(xué)院食品與化工學(xué)院副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)和功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)。

摘 要：以信陽(yáng)綠茶為原料，采用溫水浸提和醇析法提取、脫蛋白、大孔樹(shù)脂純化茶多糖和茶黃素，以 α-葡萄糖苷酶促動(dòng)力學(xué)為篩選模型，研究其對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制效果。研究結(jié)果表明，粗多糖和脫蛋白多糖的提取率分別是 3.03 % 和 1.93 %，茶黃素得率是0.42%。0.035 mg/mL的茶黃素與茶多糖對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為33.15 % 和9.74 %，茶黃素的抑制率明顯高于茶多糖。茶多糖純化程度增大，相對(duì)抑制率減少，茶葉多糖的抑制活性可能是不同分子的糖或糖與其他物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：α-葡萄糖苷酶；抑制劑；茶多糖；茶黃素

DOI：10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2024.06.020

中圖分類號(hào)：Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1008-3715（2024）06-0118-05

糖尿病是一種代謝混亂造成的慢性病，患病人數(shù)逐年增加。2021年全球糖尿病報(bào)告，全球糖尿病患者已達(dá)到 5.37 億人，預(yù)計(jì)2030全球糖尿病患者將達(dá)到6.43 億。中國(guó)糖尿病患者 2022 年達(dá)到了1.4 億人，位列世界第一。糖尿病是繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大健康殺手，其中以 Ⅱ 型糖尿病居多，其主要癥狀表現(xiàn)為餐后高血糖。α-葡萄糖苷酶抑制劑可推遲葡萄糖的轉(zhuǎn)化，可有效控制餐后血糖升高，降低并發(fā)癥的發(fā)生，可作為 II 型糖尿病的治療藥物，已上市的拜糖平、米格列醇等都是此類藥物，但多為化學(xué)合成藥物，具有一定的禁忌癥、過(guò)敏及毒副作用。天然產(chǎn)物中α-糖葡萄糖苷酶抑制劑廣泛存在，谷梁植物、傳統(tǒng)中藥、藏藥、海洋天然產(chǎn)物、微生物代謝產(chǎn)物等來(lái)源的抑制劑多有報(bào)道^［1-6］。天然產(chǎn)物中α葡萄糖苷酶抑制劑相較化學(xué)合成藥物具有更高的安全性，因此，從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)α葡萄糖苷酶抑制劑是 II 型糖尿病藥物開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。

茶葉是中國(guó)、印度和日本等國(guó)家常用的飲品之一，茶葉含有多糖、多酚、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有降血糖、抗氧化、降血脂、減肥、抑菌、調(diào)節(jié)腸道菌群、防止心血管疾病等保健作用^［7-10］。近年來(lái)，茶葉降血糖的研究逐漸增多。蔣鵬飛等^［11］研究了不同采收期香椿茶發(fā)酵前后的降糖活性，Wu Y等^［12］采用離線生物測(cè)定-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法篩選大葉黃茶中 α-葡萄糖苷酶抑制劑，霍夢(mèng)恩等^［13］研究了不同年份的烏龍茶對(duì)α-淀粉酶的抑制活性， Xiao X等^［14］研究了紅蜂蜜茶的不同提取物（二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇和水）的體外抗糖尿病和抗肥胖潛能。Wang R R等^［15］研究表明，短期和長(zhǎng)期的綠茶飲用結(jié)合運(yùn)動(dòng)可有效地緩解了脂肪肝和肥胖并發(fā)癥，通過(guò)改善肝臟炎癥、減少脂質(zhì)合成和加速葡萄糖運(yùn)輸。諸多研究成果表明，茶葉具有明顯的降糖功效，但其活性成分和作用機(jī)理，構(gòu)效關(guān)系等有待進(jìn)一步研究。

信陽(yáng)綠茶是我國(guó)“十大名茶”之一，主要產(chǎn)自河南省信陽(yáng)山區(qū)，是信陽(yáng)地區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱。信陽(yáng)綠茶的研究多集中在營(yíng)銷策略、加工工藝及抗氧化活性等方面。信陽(yáng)綠茶深加工產(chǎn)品不多，產(chǎn)業(yè)鏈延伸不足，劣質(zhì)茶葉的附加值較低。本研究以信陽(yáng)綠茶為原料，通過(guò)提取和純化，以體外酶促反應(yīng)為篩選模型，研究了茶多糖、茶黃素對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)降糖保健食品及藥物提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

信陽(yáng)綠茶，六級(jí)，河南新林茶葉有限公司。4-硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷（ PNPG ），分析純，美國(guó)E.merck公司；對(duì)硝基苯酚（ PNP ），分析純，美國(guó)E.merck公司；拜堂平，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)，721，上海第三分析儀器廠；高速臺(tái)式離心機(jī)，TGL-18C，上海安亨科學(xué)儀器廠；離心沉淀器，80-1，上海手術(shù)器械廠；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，ATR-001，華辰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉多糖的粗提

1） 粗提

綠茶 100 g 粉碎過(guò) 40 目篩，取 20 g，以 300 mL 乙醇-乙醚（ 1GA6FA1）混合液索氏提取脫脂，揮干溶劑，500 mL 水 60℃ 浸提 2.5 h，重復(fù) 2 次，趁熱過(guò)濾后合并濾液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 50 mL（真空度 0.1 Mpa），重復(fù)五次濃縮至 212.3" mL即為粗提液。

2） 粗多糖的制備

取粗提液 20 mL，加 95％ 乙醇 80 mL混勻，置于 2～5℃ 2 h， 4000 r/min 離心15 min，得沉淀，乙醇、乙醚、丙酮洗滌脫水，得粗多糖。

3） 成分檢測(cè)

參照李英等^［16］的方法鑒定樣液中蛋白質(zhì)、酚類糖類（ Molish試驗(yàn)）、皂甙和黃酮類物質(zhì)。

1.3.2 茶多糖的純化

1） 除粗多糖中蛋白

按照氯仿-正丁醇（4GA6FA1，V₁GA6FAV₂）配制混合液，粗多糖中加入等體積的混合液，搖勻后靜止 30 min，離心除去凝膠，重復(fù)三次。

2） 脫色

用5%H₂O₂ 30 mL 作用于除蛋白后的茶多糖溶液 30 min 后，自來(lái)水透析 48 h，蒸餾水透析 24 h后，真空濃縮至 20 mL， 用 95％ 乙醇 80 mL 沉淀茶多糖，于2～5℃放置 2 h，離心，沉淀物用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮洗滌脫水，干燥稱重，計(jì)算得率。

1.3.3 提取率計(jì)算

茶葉絕干質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=干燥后質(zhì)量（g）×100%/干燥前質(zhì)量（g）×100%

粗提液得率（%）=干燥后質(zhì)量（g）×212.3 mL×100%/干燥前粗提液體積（mL）×100 g茶葉×絕干質(zhì)量分?jǐn)?shù)

脫蛋白前得率E1（%）=脫蛋白前粗多糖的質(zhì)量（g/mL）×212.3 mL×100%/100 g茶葉×絕干質(zhì)量分?jǐn)?shù)

脫蛋白后得率E2（%）=脫蛋白后茶多糖的質(zhì)量（g/mL）×212.3 mL×100%/100 g茶葉×絕干質(zhì)量分?jǐn)?shù)

1.3.4 酚-硫酸比色法測(cè)糖含量

吸取樣品稀釋液1 mL，加1 mL 5％苯酚水溶液，再加5 mL濃硫酸搖勻，10 min后，放入25℃水浴中保溫20 min，以1 mL水、1 mL樣品稀釋液和5 mL濃硫酸混合液空白調(diào)零，490 nm測(cè)吸光度值。

1.3.5 大孔樹(shù)脂分離茶多糖

大孔樹(shù)脂預(yù)處理，裝柱，量取粗提液10 mL濾紙過(guò)濾后上柱，依次以水，20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇各100 mL洗脫收集，每管收集3 mL。酚-硫酸比色法測(cè)定糖含量。

1.3.6 茶黃素的提取

取粉碎的茶葉20 g 用 80％ 的150 mL乙醇水溶液 80℃ 水浴中浸提 90 min，過(guò)濾，濾液濃縮至將稠，向其中加水 20 mL，重復(fù)兩次，得濃縮液 40 mL，用CH₂Cl₂萃取其中咖啡因等（第一次1GA6FA2，第二次1GA6FA1，第三次1GA6FA1），水層用CaCl₂飽和后，緩慢加氨水至沉淀不再增加，抽濾，濾液用 2 mol/L HCl調(diào) pH 6-7，用乙酸乙酯洗滌除茶多酚，重復(fù)兩次，水相為茶黃素。

1.3.7 茶多糖和茶黃素對(duì) α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的抑制作用

1） α-葡萄糖苷酶液的制備

將土壤中篩選的七株菌和學(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種（黑曲霉、米曲霉、毛霉、根霉、青霉、紅曲霉）經(jīng)斜面活化（ 30℃，靜置培養(yǎng) 36 h ）后，無(wú)菌狀態(tài)下用接種環(huán)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中于 28 ℃ ，140 r/min，搖床培養(yǎng)五天，將發(fā)酵液在 4000 r/min條件下離心 15 min，分別收集菌體及上清液，將菌體用研缽研碎，然后以 40 mL乙酸緩沖液室溫下浸泡3h。過(guò)濾離心得胞內(nèi)粗酶液，測(cè)定酶活力。選擇酶活較高酶液為實(shí)驗(yàn)所用。

2） PNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0，1，2，3，4，5，6，7，8，9 mL pH 7.0 的 0.001％ PNP于十支干燥試管中，用蒸餾水定容到 10 mL，使其濃度在 0～64.6 μmol/mL，用 721 分光光度計(jì)400 nm測(cè)吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 α-葡萄糖苷酶促反應(yīng)模型的建立

1） 酶活力與抑制劑活力單位的定義

根據(jù)實(shí)際情況，本文把酶活力定義為在 37 ℃，pH 6.8的條件下，1 min 內(nèi)水解1 μmol PNPG 轉(zhuǎn)化為 PNP 所需的酶量，即 1 U=1 μmol/mL。酶活力計(jì)算方法：

酶活力（ u/mL ）=A×C／15×0.5

A—吸光值

C—標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率

抑制劑活力單位的定義：在 37 ℃ 下，1 min 內(nèi)降低一個(gè)酶活力單位所需的抑制劑的量。

2） 酶促反應(yīng)模型的建立

課題組考察了10，12，14，15，17 min時(shí)的酶活力。用電熱恒溫水浴鍋模仿人體溫度，用 pH 6.8 的磷酸緩沖溶液控制反應(yīng)體系 pH。根據(jù) Tremblay 等^{［ 11 ］}的方法，選 15 min 為反應(yīng)時(shí)間。

3） 酶活測(cè)定和抑制劑活性測(cè)定

移取 1 mmol /L PNPG 和pH 6.8 的緩沖溶液于四支塑料酶反應(yīng)管中，分別編號(hào)為1-1、1-2、2-1、2-2，在 37℃ 恒溫水浴中預(yù)熱 5 min，以 1-1 管為酶活空白對(duì)照，以 2-1 為酶活抑制反應(yīng)對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)體系總體積 3 mL，反應(yīng)體系用量如表 1 （抑制劑體積記為 X ）。平衡 5 min 后，立即按下表加入酶液、抑制劑、水，迅速搖勻，于 37℃ 水浴反應(yīng) 15 min 后，立即加入 37℃ 保溫的 NaCO₃ 終止液中終止反應(yīng)，用 721 分光光度計(jì)在 400 nm 處用 1 cm 比色皿測(cè)吸光值（ A ）。然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

1.3.9 茶多糖和茶黃素對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用

1） 拜堂平（阿卡波糖）對(duì) α-葡萄糖苷酶抑制作用

取2片拜堂蘋(píng)（每片50 mg ）研磨至粉末狀溶于水中定容至25 mL，溫水浴中保溫30 min，離心，取上清液，吸取上清液按1.3.8的方法做酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其抑制活性。

2） 抑制劑對(duì) α-葡萄糖苷酶酶活抑制效果的計(jì)算

計(jì)算公式：PE=（C₀-C₁）/C×V

式中： PE 為抑制劑對(duì) α-葡萄糖苷酶酶活的抑制效果，即每毫克多糖對(duì)酶活單位 U的降低值;

C₀為未加抑制劑的酶液中 α-葡萄糖苷酶的活力單位（U/mL）；

C₁為經(jīng)抑制后的酶液中 α-葡萄糖苷酶的活力單位（U/mL）；

C₀、C₁為由測(cè)得的反應(yīng)液的吸光度A據(jù)“吸光度 A-酶活力單位C”由酶活公式計(jì)算得到；

C為經(jīng)抑制劑提取液中抑制劑的質(zhì)量濃度（mg/mL）;

V為加入酶液中的多糖提取液的體積（mL）。

PER=PE/C₀

式中，PER 為每毫克抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率（ % ），其余同上式。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取率計(jì)算與影響因素

不同提取、純化階段茶多糖的產(chǎn)率如表2所示。

如表2所示，隨著提取純化的進(jìn)行，茶多糖的純度不斷提高，提取率不斷下降。脫蛋白工藝是導(dǎo)致茶多糖提取率低的一個(gè)原因，另外，中間操作不可避免的損失是導(dǎo)致提取率低的又一個(gè)原因。在提取方式上可探討超聲波等提取方式；在多糖的沉淀問(wèn)題上，為提高提取率，有必要探討丙酮沉淀的可能性。

2.2 用大孔樹(shù)脂分離茶多糖初探

經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂的粗多糖的收集液用酚-硫酸比色法跟蹤測(cè)定其相對(duì)含糖量，結(jié)果如圖1 所示。

由圖 1 可知，糖含量隨洗脫體積（或時(shí)間）變化而變化，初步推測(cè)不同分子量、不同種類的糖因其性質(zhì)的微小差別過(guò)大孔樹(shù)脂后得到相當(dāng)滿意的分離效果。實(shí)驗(yàn)采用顯色反應(yīng)對(duì)洗脫液檢測(cè)。

從 20～50 mL，60～80 mL，80～100 mL，100～110 mL，110～140 mL，140～160 mL分別檢測(cè)到6個(gè)糖組分，這已充分說(shuō)明不同組分的糖得以分離。在分離糖的同時(shí)，從120～128 mL 檢測(cè)到第一種酚類，從 172 mL到洗脫終點(diǎn)檢測(cè)到第二種酚類成分。大孔樹(shù)脂對(duì)多糖溶液中酚的良好分離是溶劑法難以達(dá)到的。

2.3 茶黃素提取條件的確定

茶黃素在中性及微堿性 pH 值和高溫條件下性質(zhì)穩(wěn)定，因此本文在pH 6～7和80℃條件下提取。

2.4 酶學(xué)特性研究

2.4.1 PNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選取400nm為測(cè)定波長(zhǎng)，由于酶分解PNPG得到的PNP的量很少，所以選用0～71.8 μmol的10個(gè)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示。

由圖2可知，回歸方程y=0.0255x-0.0268， R²=0.9993，具有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 酶反應(yīng)條件的確定

1） 底物濃度的確定

PNPG 是透明無(wú)色的，由圖 3 可以看出，底物濃度在 10 mmol/L 時(shí)，酶活力最高，但它不很穩(wěn)定，在酸性條件和常溫下容易分解為 PNP 和葡萄糖。在還沒(méi)有酶作用下就分解，并產(chǎn)生黃色色素，這對(duì)酶活的定量實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了極大的影響。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，pH 小于 6，PNPG 呈無(wú)色，然而在 pH 值增大時(shí)，顏色逐漸增加；當(dāng) PNPG 濃度大的時(shí)候，它的分解能力更強(qiáng)，加入緩沖溶液或蒸餾水的時(shí)候，黃色會(huì)突然加深，因此，采用 1 mmol的 PNPG 作為底物濃度。

2）pH 值、溫度和時(shí)間的確定

人體內(nèi)的 pH 值是中性，所以在酶反應(yīng)過(guò)程中保持pH=6.8，接近中性條件，并模仿人體溫度 37 ℃，時(shí)間選擇 15 min。

2.4.3 酶活與抑制劑活性測(cè)定結(jié)果與分析

粗提物、粗多糖、脫蛋白多糖、茶黃素測(cè)定結(jié)果以加樣體積為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，如圖 4 所示。

由圖 4可知，三種含不同純度多糖溶液的抑制率均隨抑制劑加入量的增加而增加，且曲線逐漸趨于平滑，說(shuō)明抑制效果趨于飽和；從相對(duì)抑制率來(lái)看，粗提物gt;粗多糖gt;脫蛋白多糖，說(shuō)明隨著純化程度的增大，相對(duì)抑制率減少；茶黃素有很好的抑制效果，茶黃素的濃度很低，而其最大抑制率接近于多糖；茶葉多糖粗提物較好抑制效果可能是因?yàn)榇痔嵛镏猩氐膮f(xié)同加和作用。茶黃素對(duì)α葡萄糖苷酶的抑制作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道，這一發(fā)現(xiàn)有待繼續(xù)深入研究證實(shí)，茶黃素有望成為降糖的功能因子之一。

比較0.129和0.162 mg/mL濃度的粗提物、粗多糖、脫蛋白多糖三者在同濃度情況的抑制作用，如圖5所示。

由圖 5可以看出同濃度的三個(gè)溶液粗提物的抑制效果，脫蛋白多糖 gt; 粗多糖 gt;粗提物。綜合分析，可推測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)多糖的酶抑制活性中心有包埋作用或蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合引起多糖空間構(gòu)象變化使其活性中心不能很好暴露，降低了抑制效果。除蛋白后的茶多糖因分子量降低，空間位阻減小，便于和酶的活性中心結(jié)合，對(duì)α=葡萄糖苷酶的抑制率有所提高。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)脫蛋白的多糖的抑制活性容易隨放置天數(shù)的增加而降低，粗提物活性相對(duì)穩(wěn)定。

由圖6可知，0.035 mg/mL 濃度的茶多糖與茶黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為 33.15 % 和 9.74 % ，茶黃素的抑制率明顯高于茶多糖。而且茶黃素的活性較穩(wěn)定，不容易隨放置而失活。提取相同的茶多糖和茶黃素所用原料的質(zhì)量比為 1：27.771。

2.5 多糖溶液與拜堂平抑制活性的比較

用2片拜堂平（每片50 mg ）所測(cè)得的抑制率為 38.57 % ，多糖溶液（濃度為 0.324 mg/mL）所測(cè)得的抑制率為39.73%。

3 結(jié)論

信陽(yáng)綠茶多糖純化程度增加，多糖對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率下降高，其抑制活性可能是不同分子的糖或糖與其他物質(zhì)共同作用的結(jié)果。茶黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于茶多糖，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為天然 α-葡萄糖苷酶抑制劑降糖藥物和降糖功能性食品。

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（責(zé)任編輯 李玉玲）

Inhibitory Effect of Tea Polysaccharide and Theaflavin from Xinyang Green Tea on α-glucosidase

MIN Yutao¹， SONG Yanxian^1*， XIAO Aimin¹，Wang Yuejuan²， MA Qingyi²

（1.School of Food Science and Chemical Engineering， Zhengzhou University of Technology， Zhengzhou， Henan

450044， China; 2. School of Food and Bioengineering， Zhengzhou University of

Light Industry， Zhengzhou， Henan" 450002， China）

Abstract：The Xinyang green tea was used as raw material， and tea polysaccharides and theaflavins were extracted by warm water extraction and alcoholization， deproteinized， and purified by macroporous resin. The inhibition effect on α-glucosidase was studied by using α-glucosidase kinetics as a screening model. The results showed that the extraction yields of crude polysaccharide and deproteinized polysaccharide were 3.03% and 1.93%， respectively， and the yield of theaflavin was 0.42%. Compared with the inhibitory effect of tea theaflavin and tea polysaccharide at the concentration of 0.035 mg/mL on α-glucosidase， the inhibitory rate were 33.15 % and 9.74%， respectively. The inhibitory rate of theaflavin was significantly higher than that of tea polysaccharide. With the increase of purification degree of tea polysaccharide， the relative inhibition rate decreased. The inhibition activity of tea polysaccharide may be the result of the interaction of different molecules of sugar or sugar with other substances.

Key words：glucosidase; inhibitor; tea polysaccharides; theaflavins