輻照紅細胞與普通懸浮紅細胞輸注對肝癌患者CD4+T細胞亞群水平的影響

王云鵬 張新蔚 呂旭方 馬寶亮 李小全 魏書堂 徐 麗

肝癌患者經及時治療,其5年生存率通常較高,臨床常以手術切除做為治療早期肝癌的首選方案,但肝組織減少、凝血因子減少等原因,影響患者凝血能力,因此圍術期需適當使用異體輸血輔助治療[1]。但異體輸血中部分白細胞、細胞因子等活性成分可能抑制肝癌患者細胞免疫功能,增加患者感染風險和死亡風險,可能影響患者生存期[2]。目前有研究發現,血液制品經定量射線輻照后,血液中具有免疫活性的T淋巴細胞會喪失植活、增殖能力,失去其免疫反應,可有效預防輸血相關性宿主疾病,但在肝癌患者中相關研究報道較少[3]。對此,本次研究回顧性分析輻照紅細胞與普通懸浮紅細胞輸注對肝癌患者CD4+T細胞亞群水平的影響,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年5月至2020年5月我院收治的100例肝癌患者,根據輸血紅細胞類型,將以輻照紅細胞輸注治療的65例患者納入輻照組,以普通懸浮紅細胞輸注治療的35例患者納入普通組。

納入標準:經病理活檢診斷為肝癌[4];臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期[5];術前凝血功能正常;符合肝癌手術指征;存在術后血紅蛋白(Hb)<70 g/L等輸血指征;術前無放化療史;近期無激素治療史;近期無輸血史。

排除標準:術前合并感染;臨床資料不全;術中輸血量少且術后凝血功能正常;術前嚴重貧血。

輻照組中性別(男/女):35/30例;年齡38～61歲,平均(50.02±4.98)歲;肝癌分期:Ⅰ期36例,Ⅱ期29例;病理檢查結果:肝細胞型53例,膽管細胞型12例;腫瘤最大直徑平均(3.12±0.58)cm;術前Hb水平平均(115.29±7.05)g/L。

普通組中性別(男/女):19/16例;年齡36～62歲,平均(49.58±5.07)歲;肝癌分期:Ⅰ期20例,Ⅱ期15例;病理檢查結果:肝細胞型29例,膽管細胞型6例;腫瘤最大直徑平均(3.07±0.56)cm;術前Hb水平平均(113.98±7.01)g/L。

兩組患者一般資料比較無明顯差異(P>0.05)。

1.2 治療方法

普通組患者以普通懸浮紅細胞輸注治療;輻照組患者以輻照紅細胞輸注治療,輻照射線為137Cs γ射線,輻照劑量為25 Gy。2組患者輸血量根據患者個體情況設置為2～4IU,均為懸浮紅細胞,未輸入血漿等其他成分。

1.3 指標檢測方法

外周血CD4+T細胞亞群水平檢測:①Th1、Th2:2組患者分別于輸血前、輸血后14 d時采集肝癌患者血液樣本,以肝素抗凝處理后保存,檢測時取分別0.5 ml血液樣本,加入等量刺激溶劑,輸血前樣本放入對照管中,輸血后14 d樣本放入試驗管中,加入10 μl的流式抗體溶液混勻,避光放置20 min,加入1 ml溶血素,混勻避光放置10 min,以1500 r/min轉速下離心5 min,取其下層沉淀物加入200 μl破膜劑,避光在4 ℃下放置20 min,使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,離心保留下層沉淀物,加入IFN-γ-FITC、IL-4-PE各5 μl,避光在4 ℃下放置30 min,以固定劑固定后,在流式細胞儀中檢測Th1、Th2水平。②Th17:將2組患者血液樣本加入PBS混勻,加入分離試劑分離單個核細胞,使用培養基溶液重懸細胞,將其轉移至24孔板中,分別加入丙二醇甲醚醋酸酯、蛋白質轉運抑制劑、ionomycin溶液,調整其濃度,在37 ℃、5% CO2環境下放置4 h后,將其轉移至試管中,并分別加入流式標記抗體溶液,對照管中加入等量同型抗體,避光在4 ℃下放置30 min,再次加入100 μl PBS溶液,加入1 ml固定劑,避光在4 ℃下放置30 min,加入2 ml破膜劑后離心,保留下層沉淀物,試驗管中加入流式標記抗體溶液,普通組中加入等量同型抗體,避光在4 ℃下放置30 min,洗滌后再次加入0.5 ml PBS溶液,使用流式細胞儀檢測Th17水平。③Treg:測試管中血液樣品加入流式標記抗體溶液,避光在4 ℃下放置30 min,加入PBS溶液,加入1 ml固定劑,避光在4 ℃下放置30 min,使用2 ml破膜劑洗滌2次,使用正常大鼠血清封閉15 min,測試管加入流式標記抗體溶液,對照管加入等量抗體溶液,避光在4 ℃下放置30 min,再次以0.5 ml PBS洗滌,使用流式細胞儀檢測Treg水平。

細胞因子水平檢測:分別在輸血前、輸血后14 d時采集2組患者血樣,離心取血清使用酶聯免疫試劑盒檢測其中白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、干擾素(IFN-γ)。

1.4 觀察指標

比較輸血前和輸血后14 d時,2組患者外周血CD4+T細胞亞群水平(Th1、Th2、Th17、Treg)、細胞因子水平(IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ)。比較輸血后3個月內2組患者感染發生率。輸血后隨訪3年,比較2組患者無進展生存期(PFS)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 外周血CD4+T細胞亞群水平比較

輸血前2組患者Th1、Th2、Th17、Treg水平比較無明顯差異。輸血后14 d時,輻照組患者Th1、Th17、Treg水平略高于輸血前,Th2水平略低于輸血前,差異無統計學意義(P>0.05);普通組患者Th1水平顯著低于輸血前,Th2、Treg水平顯著高于輸血前(P<0.05),Th17水平略高于輸血前,但比較差異無統計學意義(P>0.05);輻照組Th1水平顯著高于普通組,Th2、Treg水平顯著低于普通組(P<0.05),2組Th17比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 2組患者外周血CD4+T細胞亞群水平比較

2.2 細胞因子水平比較

輸血前2組患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比較無明顯差異。輸血后14 d時,輻照組患者IL-10、IL-17水平略高于輸血前,IL-2、IFN-γ水平略低于輸血前,差異無統計學意義(P>0.05);普通組患者IL-2、IFN-γ水平顯著低于輸血前,IL-10、IL-17水平顯著高于輸血前(P<0.05);輻照組患者IL-2、IFN-γ水平顯著高于普通組,IL-10、IL-17水平顯著低于普通組(P<0.05),見表2。

2.3 感染發生率比較

輸血后3個月內,輻照組感染發生率為3.08%(2/65),普通組感染發生率為8.57%(3/35),輻照組感染發生率低于普通組,差異無統計學意義(χ2=0.521,P=0.471)。

2.4 PFS比較

輻照組平均PFS為34.14個月(95%CI=31.266～35.477),普通組平均PFS為33.37個月(95%CI=32.878～34.862),2組PFS比較無統計學意義(Log Rank χ2=0.479,P=0.489),見圖1。

圖1 2組患者PFS比較

3 討論

肝癌患者圍術期由于貧血、血容量不足等原因,常使用異體輸血輔助治療,但異體輸血中部分活性因子會影響患者免疫功能,導致輸血后患者感染風險增加,不利于其回復,因此需研究適當方式緩解異體輸血對患者免疫功能的影響[6]。

CD4+T細胞亞群是免疫過程中重要成員,在抗感染、抗腫瘤中起到重要作用。其中Th1具有激活抗腫瘤活性等作用,介導細胞免疫;Th2主要分泌免疫因子,參與體液免疫;Th17細胞可分泌白細胞介素-21(IL-21)等因子,參與感染、腫瘤等疾病過程;Treg可分泌IL-10等因子,參與腫瘤免疫過程,Th1、Th2、Th17、Treg水平可反映肝癌患者免疫能力[7]。異體普通懸浮紅細胞輸注時,其中存在的部分可溶性白細胞抗原等活性物質會引起肝癌患者機體免疫功能抑制。本次研究結果中,輸血后14 d時,輻照組患者Th1、Th17、Treg水平略高于輸血前,Th2水平略低于輸血前,比較差異無統計學意義;普通組患者Th1水平顯著低于輸血前,Th2、Treg水平顯著高于輸血前,Th17水平略高于輸血前,但比較差異無統計學意義;輻照組Th1水平顯著高于普通組,Th2、Treg水平顯著低于普通組,2組Th17比較差異無統計學意義,提示輻照紅細胞輸注可明顯緩解異體輸血所致的免疫抑制。原因在于,輻照紅細胞使用定量射線照射血液,利用淋巴細胞對電離輻射敏感的特點,以特殊射線直接照射損傷細胞核,導致血液中T淋巴細胞活性喪失,并無法增殖分化,經異體輸血輸注至肝癌患者體內后,無法攻擊患者自身免疫系統,可保持肝癌患者體內CD4+T細胞亞群動態平衡,維持其正常免疫應答[8]。

IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ均為免疫因子,由CD4+T細胞亞群分泌。普通紅細胞輸注治療肝癌患者會抑制其免疫功能,從而影響其免疫因子分泌水平,提高感染風險[9]。本次研究結果中,輸血前2組患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比較無明顯差異,輸血后14d時,輻照組患者IL-10、IL-17水平略高于輸血前,IL-2、IFN-γ水平略低于輸血前,比較差異無統計學意義;普通組患者IL-2、IFN-γ水平顯著低于輸血前,IL-10、IL-17水平顯著高于輸血前;輻照組患者IL-2、IFN-γ水平顯著高于普通組,IL-10、IL-17水平顯著低于普通組;輻照組患者感染發生率低于普通組,比較差異無統計學意義;2組PFS比較無統計學意義,說明輻照紅細胞輸注可避免普通紅細胞輸注對肝癌患者免疫因子水平和感染風險的影響,輻照紅細胞、普通紅細胞輸注對肝癌患者PFS均無明顯影響。原因在于,普通紅細胞經射線輻照后免疫因子等物質均失去活性,肝癌患者輸注輻照紅細胞后,其自身免疫功能受到異體輸血的影響較小,CD4+T細胞亞群仍可維持一定范圍內的動態穩定,分泌免疫因子可維持動態穩定,因此對IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平無明顯影響[10]。輻照紅細胞輸注可減少異體輸血對肝癌患者免疫功能的影響,患者輸血后預后情況理想,對PFS無明顯影響,而普通紅細胞輸注在輸血后短期內抑制肝癌患者免疫功能,患者輸血后短期內感染風險隨之提高,本次研究結果中2組患者感染發生率比較無明顯差異可能與病例數較少有關。而患者自身機體恢復能力可幫助其陸續恢復免疫功能,因此對于其PFS也無明顯影響[11]。

綜上所述,輻照紅細胞輸注對肝癌患者CD4+T細胞亞群水平、細胞因子水平、輸血后感染風險的影響顯著低于普通紅細胞輸注,且對肝癌患者PFS無明顯影響,可作為臨床異體輸血處理參考方案之一。