益腎健脾化瘀湯通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1通路減輕STZ致大鼠腎損傷

馬怡暉,邱昌龍,李繼安,齊亞娟,楊世瑜,高裕聞,徐文軒,儲金秀

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點實驗室,河北 唐山 063210;2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 河北省中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其并發(fā)癥重點實驗室)

糖尿病(DM)主要表現(xiàn)為血糖升高和由于糖代謝紊亂引起的并發(fā)癥,由于發(fā)病機制復(fù)雜,其并發(fā)癥的研究也日漸成為熱門研究方向[1-2]。由于高血糖引起的腎臟損傷是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因[3-4]。氧化應(yīng)激(OS)是由于機體內(nèi)的氧化和抗氧化水平異常后的一種應(yīng)激狀態(tài)。正常情況下,機體內(nèi)環(huán)境中氧化系統(tǒng)保持穩(wěn)定,但持續(xù)的高血糖會導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂,隨后正常的氧化抗氧化穩(wěn)態(tài)水平受到破壞,引起了一系列的氧化應(yīng)激損傷,而腎臟是人體代謝的重要器官,參與著正常的氧化抗氧化過程。在中醫(yī)古籍中雖然沒有DM等病名記載,但現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)上認為DM的腎損傷屬于消渴、水腫等范疇,普遍認為此病的病性以虛為主,標實本虛[4-5],有研究表明,單味藥對DM腎損傷的治療是顯著的,其中已經(jīng)明確的有黃芪、大黃、山藥等,均可達到減緩腎損傷的作用[6-8]。本課題組在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下自擬益腎健脾化瘀湯(YJHD),通過對相關(guān)指標的檢測,從Keap1/Nrf2/HO-1通路出發(fā),探討此方對氧化應(yīng)激的影響及DM大鼠腎損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物:60只SD大鼠,體重240～260 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)溫度20～28 ℃,濕度40%～60%,自由攝食攝水,所有條件符合動物中心倫理審查標準。

1.2藥物及劑量:益腎健脾化瘀湯中藥材購自河北林益堂藥業(yè)有限公司,黃芪、山藥、山茱萸、白術(shù)、茯苓、桃仁、澤瀉、牡丹皮、牛膝、車前子、桂枝、大黃,加水煎煮3.36 g/ml,按照1 ml/100 g灌胃給藥。

1.3方法

1.3.1分組、給藥及造模:60只SD雄性大鼠,隨機選取10只作為對照組,其余50只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng),4 w后腹腔注射STZ,劑量為35 mg/kg,對照組注射等容積的枸櫞酸鈉鹽緩沖液,造模72 h后測定各組大鼠的空腹血糖(FBG)和餐后血糖(PBG),當FBG≥11.1 mmol/L、PBG≥16.7 mmol/L時認定造模成功;將造模成功的40只大鼠按照每組10只隨機分為模型組、YJHD低劑量組、高劑量組和陽性藥物組[卡格列凈(CANA)組],其中YJHD低、高劑量組每日的給藥劑量為16.8 g/kg和33.6 g/kg,CANA組每日的給藥劑量為9 mg/kg,連續(xù)灌胃8 w,同時模型組灌胃等容積的蒸餾水。給藥結(jié)束后,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉,取材。

1.3.2測定體重、血糖:記錄給藥期間各組大鼠的體重變化情況,取材前禁食不禁水過夜,用一次性采血針吸取尾尖血后用快速血糖儀測定并記錄為FBG,禁食12 h后分別于0、30、60、90、120 min時測定血糖值,繪制OGTT圖并計算曲線下面積(AUC)。

1.3.3測定腎功能、氧化應(yīng)激指標:取材前收集尿液,隨后按照說明書測定24 h尿蛋白含量,麻醉后腹主動脈取血,獲得血清樣本,按照說明書步驟規(guī)范操作,用于檢測肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)水平,同樣的血清樣本測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)。

1.3.4HE染色觀察腎組織:將甲醛固定好的腎組織放入包埋盒中放入脫水機中過缸脫水、包埋,制成4 μm厚度的石蠟切片,常規(guī)脫蠟,按照說明書染色順序操作,鏡下觀察并拍照。

1.3.5測定核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kelch樣相關(guān)蛋白1(Keap1)及血紅素氧合酶1(HO-1)在腎組織中的表達:將凍存的組織取出稱量,剪碎后加入RIPA組織裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑,提取上清后根據(jù)繪制好的標準曲線計算樣本蛋白濃度,制備成蛋白上樣液,隨后制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉,滴加兔抗的Nrf2 (1∶2 000)、鼠抗的Keap1(1∶1 000)、鼠抗的HO-1(1∶1 000)及鼠抗的β-actin(1∶10 000)一抗孵育,滴加HRP標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗(1∶3 000)孵育,采用ECL超敏發(fā)光染液染色,置于Image Lab進行曝光。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1體重、血糖的檢測:與對照組相比,高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體重在前4 w內(nèi)迅速上升,在注射過STZ后,體重開始下降,模型組的體重持續(xù)不斷降低,在實驗結(jié)束時處于最低位置,與模型組相比,YJHD給藥組大鼠自給藥起其體重的下降速度有所緩解,見圖1。

圖1 實驗期間各組大鼠體重變化情況

與對照組相比,模型組FBG、OGTT、AUC水平都明顯升高(P<0.01),與模型組相比,YJHD低、高劑量組FBG下降明顯(P<0.01),OGTT在30 min后有明顯下降趨勢,其AUC也有所降低(P<0.05),與CANA組相比,YJHD低、高劑量組FBG和OGTT-AUC值仍有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 FBG水平、 口服糖耐量試驗、口服糖耐量試驗曲線下面積比較

2.2腎功能檢測:與對照組相比,模型組尿蛋白、Cre、BUN水平都明顯升高(P<0.01),而與模型組相比,除了YJHD低劑量組Cre水平?jīng)]有顯著差異外,YJHD低劑量組尿蛋白、BUN水平以及YJHD高劑量組尿蛋白、Cre、BUN水平都明顯下降,有顯著差異(P<0.05),與陽性組相比,除YJHD低劑量組尿蛋白、 YJHD高劑量組Cre無顯著差異外,其余均有顯著差異(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠尿蛋白、血Cre、BUN水平比較

2.3氧化應(yīng)激水平檢測:與對照組相比,模型組SOD、GSH-Px和CAT水平明顯下降(P<0.05、P<0.01),MDA水平明顯升高(P<0.01),而與模型組相比,除了YJHD低劑量組的CAT水平無顯著差異外(P>0.05),YJHD低、高劑量組SOD、GSH-Px和CAT水平都有明顯提高(P<0.05),MDA水平可見下降 (P<0.05),與陽性組相比,YJHD低劑量組CAT水平和YJHD低、高劑量組GSH-Px有顯著差異(P<0.05)外,其余均無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 大鼠SOD、GSH-Px、CAT及MDA水平比較

2.4腎臟病理改變情況:與對照組相比,模型組的腎小球明顯萎縮,腎小管緊湊,間質(zhì)縫隙變小,可能存在腫脹,可見周圍伴有大量炎性細胞增生,腎小管間質(zhì)內(nèi)存在大量紅細胞,可能發(fā)生充血、淤血,與模型組相比,YJHD低、高劑量組中腎小球萎縮情況有所好轉(zhuǎn),腫脹情況有緩解,周圍細胞增生情況明顯減少,淤血充血現(xiàn)象減少。見圖2。

圖2 大鼠腎臟HE染色(×200)

2.5腎組織中Nrf2、Keap1及HO-1的表達情況:與對照組相比,模型組Keap1蛋白表達顯著升高(P<0.01),Nrf2和HO-1的蛋白表達下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,YJHD低、高劑量和陽性組的Keap1蛋白表達顯著降低(P<0.01),Nrf2和HO-1的蛋白表達有明顯上升(P<0.01)。見表4、圖3。

表4 大鼠腎組織中Keap1、Nrf2、HO-1的檢測

圖3 大鼠腎組織中Keap1、Nrf2、HO-1的檢測

3 討論

DM是目前最為流行的一種代謝性疾病之一,目前分為兩種形式,一種是胰島素依賴型DM,稱為1型糖尿病(T1DM),另一種是非胰島素依賴型糖尿病,稱為2型糖尿病(T2DM)。T2DM是DM最常見的一種形式,占所有患病類型的90%～95%[9]。本研究采用的高脂飼料聯(lián)合單詞小劑量注射STZ是目前最常用的一種建立動物模型的方式,高脂飼料可以誘導(dǎo)胰島素抵抗,機體對葡萄糖的利用率下降,再注射STZ后β細胞被破壞,損傷了胰島功能進而模擬了T2DM的發(fā)病過程[10-11]。

DM的并發(fā)癥目前是世界范圍內(nèi)研究的主流,由于高血糖引起的腎臟損傷是導(dǎo)致腎衰竭的主要原因之一[12-13],其病變可以累及腎臟組織中的腎小球、腎小管等,有研究表明,引起這些損傷的重要原因是由于機體在長期糖代謝紊亂的狀態(tài)下引起的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激指的是機體的氧化和抗氧化水平失衡時的一種應(yīng)激狀態(tài),由于體內(nèi)某些高活性分子在機體遭受到有害刺激時過度產(chǎn)生而導(dǎo)致的氧化水平過高[14],進而引起組織損傷,這些高分子物質(zhì)就包括活性氧。活性氧可以參與機體多個環(huán)節(jié),正常狀態(tài)下它的水平保持相對恒定,但當機體處于高糖狀態(tài)時,活性氧產(chǎn)生過多引起了自身氧化,高于正常時機體的抗氧化能力,就造成了氧化應(yīng)激損傷[15-16],而腎臟是產(chǎn)生活性氧的主要組織器官。

Nrf2是目前發(fā)現(xiàn)的與氧化應(yīng)激最密切的調(diào)節(jié)因子之一,作為一種轉(zhuǎn)錄因子,它在機體高糖引起氧化應(yīng)激時起著保護作用。而Keap1是Nrf2的主要抑制蛋白[17-18],正常時與Nrf2結(jié)合并抑制其泛素化以保持穩(wěn)定,但當氧化應(yīng)激時,Keap1構(gòu)象的改變使Nrf2的抑制狀態(tài)解除,與下游的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,進而啟動了血紅素氧合酶1(HO-1)基因的轉(zhuǎn)錄,其中,HO-1是一種重要的抗氧化酶[19-20]。

中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn),單味藥對DM所致腎損傷的治療是顯著的,如黃芪、白術(shù)、山藥等,都可以有效地降低血糖水平,增加Nrf2的表達,促進其與各類抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,減輕氧化應(yīng)激損傷[21-24];除單味藥的治療外,目前臨床使用更多的是各類中藥復(fù)方,如復(fù)方黃芪湯可通過減輕機體內(nèi)炎性反應(yīng),改善各項腎損傷指標來減緩腎損傷發(fā)展[25];健脾固腎方有著細胞內(nèi)外基質(zhì)的代謝、提高抗氧化能力等作用效果[26],各復(fù)方由已經(jīng)研究證實過的,從降脂、降糖、抗炎等方面對腎臟損傷有明顯改善的單味藥構(gòu)成,因此,本課題組老師基于中醫(yī)理論,自擬益腎健脾化瘀湯,通過氧化應(yīng)激相關(guān)途徑觀察藥物在高糖下對腎臟損傷的緩解情況。

本研究結(jié)果顯示,益腎健脾化瘀湯可以很好地改善由STZ誘導(dǎo)的DM大鼠模型中的腎損傷,緩解腎臟中的炎細胞增生浸潤情況,可以改善腎功能損傷,緩解氧化應(yīng)激損傷,同時,影響了腎組織中Keap1/Nrf2/HO-1通路上的蛋白表達。綜上所述,益腎健脾化瘀湯可以改善腎功能的損傷,緩解氧化應(yīng)激帶來的損傷并可能是通過Nrf2途徑實現(xiàn)對腎臟的保護作用的。