LINC00310在胰腺癌中的高表達及其靶向功能預測

危丹明,李建棣,譚 洋,顏詩白,李建軍,黃志廣,黨裔武,陳 罡,何 娟

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院病理科,廣西 南寧 530021;2.廣西醫科大學第二附屬醫院普通外科)

胰腺癌是消化系統中惡性程度極高的腫瘤之一,全球致死腫瘤中排第7位[1-2]。我國國家癌癥中心數據顯示男性惡性腫瘤發病率中胰腺癌排第7位,在女性排第11位[3]。手術切除是目前治療胰腺癌的主要方法,但多數胰腺癌患者確診時處于進展期或已發生轉移,預后極差。因此,需早期有效的診斷及高效的靶向治療藥物。近年來,隨著高通量測序技術的發展及各大數據平臺的免費開放,趨于大數據的挖掘分析,益于尋找新的腫瘤分子診斷、預后標志物及治療靶點。同時愈來愈多的研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)是無蛋白編碼功能的長度>200 bp的RNA,在基因調控、正常細胞功能和疾病過程中發揮重要作用,且可作為癌癥的診斷及預后標志物[4]?；蜷g的長鏈間非編碼RNA(lincRNA)是其具有代表性的一種。盡管目前已發現有lncRNAs在胰腺癌的發生發展中發揮重要的作用,但僅少數lncRNAs可檢測胰腺癌的潛在診斷及預后生物標志物[5-6]。研究發現LINC00310在乳腺癌中上調并與腫瘤復發有關[7],通過C-myc的表達發揮作用,可作為乳腺癌診斷的潛在標志物[8]。關于胰腺癌中LINC00310的表達情況及其相關預測,目前國內外均無報道。為了填補這一空白,本文研究分析其在胰腺癌中的差異表達及靶向功能,探索胰腺癌中潛在的新的診斷分子標志物,為后續的相關信號通路及耐藥研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1胰腺癌轉錄組數據獲取:在基因表達數據庫(GEO)、ArrayExpress、癌癥基因組圖譜(TCGA)、序列讀取存檔(SRA)檢索胰腺癌mRNA、lncRNA及miRNA芯片、RNA-seq數據。樣本納入標準:①人類原發性胰腺癌組織及正常胰腺組織(miRNA數據集樣本類型為體液);②樣本量≥6。過濾標準:①未提供表達矩陣、原始數據或探針注釋信息;②不常見的胰腺癌類型(如未分化癌、黏液癌等);③重復樣本。合并基因型-組織表達(GTEx)正常胰腺組織測序數據與癌癥基因組圖譜-胰腺腺癌(TCGA-PAAD)數據,增加對照組樣本量;合并GEO同一平臺數據集。合并后數據集的批次效應的去除,對表達數據進行標準化分析。從標準化矩陣中提取LINC00310表達值備用。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2標準化平均差整合分析:計算相比于非胰腺癌組織的LINC00310表達值標準平均差(SMD),森林圖繪制及合并SMD效應量。異質性檢驗結果選擇相應模型:I2>50%選擇隨機效應模型,I2≤50%選擇固定效應模型。

1.3匯總受試者工作特征(sROC)曲線分析:繪制sROC曲線圖,計算曲線下面積(AUC)。敏感度森林圖、特異度森林圖及似然比森林圖的繪制。

1.4整合差異分析:利用標準化矩陣,分別計算mRNA及miRNA在胰腺癌組織、體液中的表達水平SMD值,鑒定差異表達mRNA及miRNA:SMD值95%可信區間不包含0。

1.5LINC00310-miRNA-mRNA網絡構建:基于預測“multiMiR”程序包預測分析LINC00310靶向miRNA并獲取miRNA的mRNA靶基因。miRNA靶向調控的mRNA經過雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證。將LINC00310靶向miRNA、miRNA靶向調控mRNA分別與胰腺癌差異表達miRNA、胰腺癌差異表達mRNA交集,用Cytoscape v3.9.0構建lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡。

1.6基因集合富集分析:利用“clusterProfiler”對LINC00310-miRNA-mRNA調控網絡的基因功能進行注釋分析。繪制氣泡圖、通路富集網絡圖。

1.7統計學分析:統計分析在Stata v12.0及R v4.2.0中完成,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1LINC00310在胰腺癌組織中表達增高:本研究基于平臺數據集,整合分析727例胰腺癌及548例周圍正常胰腺組織對照樣本中的LINC00310表達量,可見LINC00310表達水平在胰腺癌中表達增高,其SMD值為0.17[0.06,0.29]。見圖1A。未見明顯發表偏倚,故整合分析結果可靠。見圖1B。2.2LINC00310高表達對胰腺癌存在區分能力:LINC00310在胰腺癌及周圍正常胰腺組織的區別方面,其 sROC AUC 為 0.64 [0.60,0.68]。見圖1C,敏感度及特異度分別為 0.44 [0.25,0.66]、0.76 [0.54,0.90]。見圖2A,2B。陽性似然比、陰性似然比森林圖結果提示LINC00310 用于區分胰腺導管腺癌的準確性欠佳。見圖2C,2D。

圖1 LINC00310在胰腺癌組織的表達水平

圖2 LINC00310高表達對胰腺癌組織的區分效能

2.3胰腺癌LINC00310-miRNA-mRNA調控網絡:LINC00310預測調控的miRNA 105個,在胰腺癌中顯著高表達12個及顯著低表達4個。其中高表達的miR-346,miR-596,miR-103a-2-5p,miR-661,miR-384及miR-15a-5p,低表達的miR-4284及miR-1182被預測參與LINC00310調控網絡。見圖3。上述8個miRNA調控的差異表達mRNA有 46個(下調15個及上調31個),均已經過熒光素酶報告基因檢測實驗驗證。

2.4LINC00310-miRNA-mRNA調控軸基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析:LINC00310參與的ceRNA GO功能富集分析結果。見圖4。顯示可能參與的生物過程(BP)包括對放射的反應、肽基絲氨酸磷酸化、修飾及肽基酪氨酸磷酸化、修飾等,同時細胞成分(CC)主要富集在轉移酶復合物(轉移含有磷的復合物)、核染色體及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等,而分子功能(MF)富集結果主要集中在DNA結合轉錄因子結合功能、信號受體激活劑的活性、泛素蛋白連接酶結合功能、泛素樣蛋白連接酶結合功能及細胞因子活性等。KEGG功能富集分析結果顯示LINC00310 ceRNA可能參與的是PI3K-Akt信號通路。見圖5。涉及的相關信號分子在信號通路中已經被標注顯示。見圖6。

圖4 胰腺癌 LINC00310-miRNA-mRNA調控軸GO富集分析

圖5 胰腺癌 LINC00310-miRNA-mRNA調控軸KEGG富集分析

圖6 胰腺癌 LINC00310競爭性結合miRNA調節mRNA參與PI3K-Akt信號通路

3 討論

胰腺癌在全球范圍內發病率持續上升。鑒于胰腺癌早期診斷較難、手術切除率不高及術后復發轉移率不低的特點,胰腺癌為消化系統預后極差的腫瘤之一,臨床診斷及治療極具有挑戰性。血清CA19-9除了是目前臨床胰腺癌常用的診斷標志物之外,亦可用于預后評估及效果評價。但Lewis抗原陰性的患者不表達CA19-9及在感染狀態或膽道梗阻情況下可出現CA19-9的升高。

鑒于血清腫瘤標志物CA19-9、治療方面及治療后效果評價的局限性,lncRNA生物學標記篩選、靶點預測及療效評價中顯現潛在的應用前景。胰腺癌診斷標志物方面的研究,lncRNAs中H19外顯子轉錄本(H19)、HOX基因反義RNA(HOTAIR)、HOXA基因遠程反義RNA(HOTTIP)、肺腺癌轉移相關RNA1(MALAT1)及漿細胞癌變異轉位1(PVT1)被認為是具有潛力的lncRNA生物標志物[9]。與良性的胰腺腫瘤及正常胰腺組織相比較,HOTAIR、HOTTIP及PVT1在胰腺癌組織中均明顯升高[5]。MALAT1的研究方面顯示在胰腺癌組織與正常組織的比較ROC AUC為0.69,敏感性為0.78及特異性為0.60[10]。相繼來自Oncomine、GEO及CTGA三大數據庫的數據分析顯示MALAT1在胰腺中具有中度診斷價值(AUC為0.75,敏感性為0.66及特異性為0.72)[11]。LINC00310在胰腺癌表達情況及與正常胰腺組織相比是否存在差異性表達,可否成為潛在的胰腺癌潛在診斷標志物,目前國內外文獻均無相關報道,鑒于此,本研究首次進行了LINC00310在胰腺癌的差異性表達分析,結果顯示與正常胰腺組織相比,胰腺癌組織中LINC00310存在高表達,可為胰腺癌診斷潛在生物標記方面進行了補充。研究報道與非胰腺癌患者相比,在胰腺癌唾液、血漿及唾液中檢測到lncRNAs的高表達[5,12],提示體液中的lncRNAs水平存在胰腺癌診斷鑒別價值。后續試驗中可進行在體液中檢測LINC00310的差異性表達分析。

除了胰腺癌相關診斷標志物,胰腺癌潛在的預后標志物亦相繼被報道[9]。長鏈非編碼RNA OIP5-AS1(LncRNA-OIP5-AS1)在胰腺癌組織表達增多且與腫瘤大小、遠處轉移及腫瘤-淋巴結-遠處轉移(TNM)分期呈正相關。長鏈非編碼RNA X-染色體失活特異性轉錄本(LncRNA-XIST)在胰腺癌組織及細胞系中高表達及其表達量與預后呈負相關,而長鏈非編碼RNA癌癥易感基因候選2(LncRNA-CASC2)在胰腺癌組織及細胞系中低表達及其表達量與預后呈正相關。LncRNA-linc00671的表達與腫瘤分化、臨床分期及差預后呈負相關[9]。

胰腺癌的早期診斷率及手術切除率均較低,化療仍是胰腺癌治療的關鍵。吉西他濱是晚期胰腺癌治療的一線化療藥物,與其他化療藥聯合使用,但生存率的改善常不理想,耐藥相關的機制研究顯得尤為重要[13]。研究顯示PVT1參與胰腺癌的發生發展及化療耐受,PVT1通過Wnt/β-catenin信號及自噬介導化療耐受[14]?；熀笠认侔┗颊唧w內LINC00310的變化情況值得進一步分析,其與化療耐受的相關性及耐藥機制亦有待探索。

胰腺癌的發生過程中涉及多條信號通路,包括磷脂酰肌醇 3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路、轉化生長因子β通路及Wnt通路等[14-17]。LINC00310競爭性結合miRNA調節mRNA參與PI3K-Akt信號通路,其中部分基因與胰腺癌的相關研究被報道,如在LINC00310-miRNA-mRNA調控網絡中呈表達上調的MYB轉錄因子(MYB)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)及胰島素受體底物1(IRS1)。MYB在胰腺癌細胞中高表達,在胰腺腫瘤生長及轉移中起到重要的作用[18]。GSK3β是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶,調節細胞增殖、DNA修復、信號轉導和代謝途徑等。GSK3β的異常表達增多參與胰腺癌的發生及進展,并與化療藥耐受相關,可成為克服耐藥的潛在靶點[19]。IRS1在胰島素及胰島素樣生長因子-1(IGF1)受體傳導至PI3K/AKT信號通路過程中發揮重要的作用[20-21]。IRS1在胰腺癌化療耐藥發揮重要的作用及抑制IRS1可改善化療耐藥[21]。結直腸癌差異表達的長鏈非編碼RNA(LncRNA-CRNDE)海綿吸附miR-384上調IRS1促進胰腺癌細胞的增生及轉移[22]。LINC00310可能通過miR-384及IRS1參與的PI3K/AKT通路信號傳導在胰腺癌的發生及進展中發揮作用。

綜上所述,本研究發現LINC00310在胰腺癌組織中表達增高且可能通過PI3K/Akt信號通路發揮致癌作用,預示其可能成為臨床胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物,為LINC00310的胰腺癌預后相關、致癌機制及化療耐藥研究奠定基礎。靶向通過PI3K/Akt信號通路調控胰腺癌生物學性狀的LINC00310可為胰腺癌提供新的診治方案及診療思路。