葛根多糖對貓腸道菌群的影響

趙世帆， 薛華磊， 陳 凱， 李 曉， 王 米

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學藥物及制劑學重點實驗室，上海200241）

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展， 人們生活水平日益提高，消費觀念也日漸更新，絕大對數(shù)人除了在支付養(yǎng)寵物的日常開支外， 也更希望能把寵物養(yǎng)好、 養(yǎng)健康。 因此寵物食品也受到越來越多的關(guān)注。在寵物飼養(yǎng)過程中，由于寵物和人飲食結(jié)構(gòu)的不同，以及在傳染病的感染下，導致寵物胃腸道疾病頻發(fā)。隨著飼主對寵物食品要求的提高，加強對無抗、無殘留，具有改善腸道菌群、促進腸道健康、增強機體免疫力的天然植物成分的研究和開發(fā)，對寵物飼料行業(yè)具有重要意義。

葛根（Pueraria lobata）為豆科植物野葛的干燥根，主要分布于我國遼寧、河北、河南、山東、安徽、江蘇、浙江、福建、臺灣、廣東等地，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉等功效（中國獸藥典委員會，2020）。葛根中的主要成分包括葛根素、異黃酮類、多糖等（Wang 等，2020），具有抗炎抗氧化（Zhao 等，2022；Dong 等，2020）、 抗 糖 尿 病（Luo等，2021；Yang 等，2019）、 保護心血管 （Lv 等，2022；Jiang 等，2022）、抗腫瘤（Fang 等，2022）等活性。本課題組前期發(fā)現(xiàn)葛根多糖具有免疫調(diào)節(jié)，改善小鼠腸道菌群（陳融等，2021；Chen 等，2020）的功效。當前，葛根多糖對于貓腸道菌群影響的研究鮮見報道。 本試驗給健康家貓飼喂葛根多糖后收集糞便，通過高通量測序，研究葛根多糖對貓腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度的影響， 探究葛根多糖作為改善寵物腸道健康的飼料添加劑的可能性。

1 材料與方法

1.1 葛根多糖制備 葛根購于上海雷允上中藥飲片有限公司。 將葛根用石油醚回流法去除脂質(zhì)和色素等雜質(zhì)后， 使用水提醇沉法獲得葛根粗多糖； 酶解法和Sevage 試劑法除去淀粉和蛋白質(zhì)，通過透析除去小分子物質(zhì)。 使用苯酚-硫酸法和酶標儀檢測并收集葛根多糖溶液， 烘干后得到葛根多糖。

1.2 試驗動物 健康成年家貓8 只（公母各半），體重2.5 ~ 3.7 kg，試驗動物來源于貓舍，所有貓飼養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物實驗中心，室溫控制在（22±2）℃。

1.3 儀器和試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R206B）購自上海申生科技有限公司；真空泵（SHB -ⅢA）購自上海豫康科技儀器設備有限公司； 酶標儀（Multiskan MK3，美國賽默飛世爾），純水機（JMCDCNF1LS，德國默克密理博）），自動部分收集器（SBS-100）和恒流泵（HL-2）均購自于上海滬西分析儀器廠有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A）購自上海習仁科學儀器有限公司。

無水乙醇、苯酚、濃硫酸、氯仿、三氯甲烷等購自國藥企業(yè)；α-淀粉酶購自西格瑪奧德里奇 （上海）貿(mào)易有限公司。

1.4 試驗設計 將8 只家貓隨機分為2 組，每組4 只貓（兩只公貓，兩只母貓），每只貓單獨飼養(yǎng)在籠中。對照組（W 組）和試驗組（E 組）自由飲水和采食成貓日糧，E 組每天定時按體重飼喂3.75 mg/kg葛根多糖溶液，共飼喂30 d。

1.5 測試指標及方法

1.5.1 樣品采集 試驗最后1 d， 收集每只家貓糞便， 于超凈工作臺中取中間干凈無其他污染物的糞便置于1.5 mL EP 管中，-80 ℃保存。

1.5.2 基因組DNA 提取、PCR 擴增和測序 基因組DNA 提取、PCR 擴增和測序均由上海派森諾生物技術(shù)公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件（IBM，Chicago，IL）進行t 檢驗分析。 數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 Alpha 多樣性分析

2.1.1 稀釋曲線 （Rarefaction Curve） 和Shannon曲線 稀釋曲線和Shannon 曲線反映了測序深度是否合適。 曲線的平緩程度反映了測序深度對于觀測樣本多樣性的影響大小，曲線越平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新ASV/OUT。 由圖1 可知，當樣品測序深度達到8000 reads 時，Alpha 多樣性開始接近飽和， 表明該數(shù)據(jù)量已足夠進行樣品菌群多樣性分析。 除此之外，稀釋曲線還可以比較不同樣本中ASV/OTU數(shù)的多少， 從一定程度上反映出試驗組樣本多樣性高于對照組。

圖1 稀釋曲線（A）和Shannon 曲線（B）

2.1.2 Alpha 多樣性分析 圖2 顯示，E 組的豐富度（Chao1）、多樣性（Shannon）、優(yōu)勢度（Simpson）和進化的多樣性（Faith’ PD）均顯著高于W 組，表示糞便中微生物群落的總數(shù)和多樣性發(fā)生了變化；各組覆蓋度（Goods_coverage）均高于99%，表明本次測序結(jié)果代表了糞便微生物群落的真實情況。

圖2 葛根多糖對Alpha 多樣性指數(shù)的影響

2.1.3 Beta 多樣性 主坐標分析（PCoA）利用樣本中物種（ASV/OTU）的豐度信息、特征/代表序列間的進化關(guān)系等信息進行計算， 將多維度的物種數(shù)據(jù)降成一維數(shù)據(jù)——樣本差異距離， 從而在不同的角度表征這兩個樣本間的群落差異。 從圖3可以看出， 試驗組和對照組的群落組成存在顯著差異，說明葛根多糖能夠改善腸道群落組成。

圖3 基于加權(quán)與未加權(quán)UniFrac 距離的PCoA

2.2 家貓糞便菌群差異顯著分析 根據(jù)韋恩圖（圖4-A），兩組樣本中共有511 種常見OUT（Operational Taxonomic Units）， 試驗組和對照組分別特有628 和636 種OUT。

圖4 ASV/OUT 的韋恩圖（A）、分類學分枝圖（B）和LDA 值分布柱狀圖（C）

LEfSe 分析是一種差異分析方法， 在直接對所有分類水平進行差異分析的同時， 可以深入到不同的子分組（Subgroup）中，挑取在不同子分組中表現(xiàn)一致的標志微生物類群。 LEfSe 的分析結(jié)果包括兩部分，分別是物種分類學分枝圖（Cladogram）（圖4-B）和顯著差異物種LDA 值分布柱狀圖（圖4-C）。 圖5 是在門和屬水平上的各組腸道菌群相對豐度的顯著性差異分析。結(jié)果顯示，在門水 平 上，厚 壁 菌 門（Firmicutes）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是主要的優(yōu)勢物種；在屬水平上，罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是主要的優(yōu)勢物種。

圖5 菌群相對豐度變化圖

3 討論

腸道菌群數(shù)量龐大種類繁多，是一個相互作用相互競爭的群體。 腸道菌群的多樣性反映了腸道環(huán)境的健康程度以及抵抗疾病的能力。 有研究表明多種疾病與腸道菌群多樣性存在密切關(guān)系：陸江等（2020）的研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰竭可以使犬腸道菌群多樣性降低、 菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)以及菌群功能改變； 在仔豬中腸道微生物多樣性的改變會導致仔豬腹瀉的發(fā)生（唐勛，2019）。 本試驗Alpha 多樣性分析和Bate 多樣性分析探究了葛根多糖對家貓腸道微生物多樣性的影響。Alpha 多樣性分析能夠反映微生物群落的總數(shù)和多樣性， 試驗組的豐富度 （Chao1）、 多樣性（Shannon）、優(yōu) 勢 度（Simpson）和 進 化 的 多 樣 性（Faith’ PD）均顯著高于對照組，表明葛根多糖能夠提高家貓腸道種微生物群落總數(shù)， 增加微生物群落多樣性。在Bate 多樣性分析中，試驗組中的菌落組成和對照組存在明顯差異， 反映出葛根多糖能夠影響菌落組成。 進一步分析微生物群落種類顯示兩組樣本中共有511 種常見OUT， 試驗組和對照組分別特有628 和636 種OUT。結(jié)果表明葛根多糖能夠改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增強腸道菌群多樣性。

腸道菌群能夠幫助宿主分解和消化營養(yǎng)物質(zhì)，其代謝產(chǎn)物能夠幫助維持腸道環(huán)境平衡，提高宿主從飲食中獲得能量的能力。 其中的有益菌極為重要。 在一些研究中擬桿菌門參與了癌癥免疫治療和預防（Zafar 等，2021）；雙歧桿菌與人類健康有很大關(guān)系且具有多種多樣的生物學功能， 如免疫調(diào)節(jié) （Choi 等，2022；Henrick 等，2021），抗腫瘤活性（Yin 等，2014），抗致病性作用，抗炎、抗衰老等（Luo 等，2018）。除此之外，放線菌屬等有害菌也存在于腸道環(huán)境中。 本試驗在家貓糞便中檢測到在門水平上厚壁菌門、放線菌門、變形桿菌門、擬桿菌門是主要的優(yōu)勢物種；在屬水平上，罕見小球菌屬、雙歧桿菌屬是主要的優(yōu)勢物種。 葛根多糖能夠提高有益菌擬桿菌門、 雙歧桿菌屬和罕見小球均屬的相對豐度，降低放線菌門、厚壁菌門的相對豐度。 結(jié)果表明葛根多糖能夠提高有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明， 葛根多糖能夠改善貓的腸道微生物內(nèi)環(huán)境，提高其腸道菌群多樣性，改善腸道健康， 可以開發(fā)成為改善寵物腸道健康的飼料添加劑。