組蛋白密碼在骨髓增生異常綜合征中的研究進展△

王冬琴，任建業

上海中醫藥大學附屬市中醫醫院血液科，上海 2000710

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）由一組具有骨髓衰竭特征的異質性骨髓腫瘤組成，主要臨床特征包括造血功能障礙、形態學發育不良和外周血細胞減少等[1]。伴有多系血細胞減少、骨髓原始細胞比例升高或特征性染色體異常的MDS 患者通常會迅速進展為急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML），最終在未進行骨髓移植的情況下死亡[2]。組蛋白修飾是一種重要的表觀標志，而組蛋白密碼是組蛋白修飾在時間和空間上的組合，由組蛋白非結構化的氨基酸末端（N 端）尾巴空間位置、修飾類型、基團數量及修飾發生的時間共同構成，常見的組蛋白修飾存在于不同類型修飾酶作用環節的翻譯過程中。骨髓腫瘤細胞核內各種效應蛋白與組蛋白修飾后的相應靶點結合，控制著MDS 細胞核染色體結構和基因表達調控等表觀遺傳現象，進而介導腫瘤細胞生長、凋亡、自噬及免疫反應等生命過程，因此組蛋白密碼變換在MDS 發生發展過程中具有關鍵作用，研究相關分子標志物有助于理解MDS 的生物學行為，為MDS 的診治提供重要信息。本文對組蛋白密碼在MDS 中的研究進展進行綜述。

1 組蛋白甲基化與MDS

組蛋白甲基轉移酶及去甲基化酶能夠動態調節組蛋白3（histone 3，H3）或組蛋白4（histone 4，H4）N 端精氨酸R1、R2 位點和賴氨酸K1、K2、K3殘基的甲基化水平，其中K 位點的甲基化由組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（histone lysine methyltransferase，HKMT）和組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）或含有Jumonji 結構域的組蛋白賴氨酸去甲基化酶蛋白家族共同催化完成。根據各位點的甲基化基團數目，賴氨酸殘基可單甲基化（me1）、雙甲基化（me2，對稱或非對稱）和三甲基化（me3）。精氨酸殘基同樣能夠被單甲基化和雙甲基化修飾，主要由蛋白質精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）家族部分成員催化完成。組蛋白的K位點甲基化是迄今為止MDS 研究最為廣泛的一組組蛋白密碼形式。目前已有靶向組蛋白甲基轉移酶的抑制劑，其中一些已在AML 中顯示出抗腫瘤活性。

1.1 組蛋白3 賴氨酸4（lysine 4 of histone 3，H3K4）甲基化

H3K4 可以發生單甲基化（H3K4me）、雙甲基化（H3K4me2）及三甲基化（H3K4me3），由賴氨酸甲基轉移酶2（lysine methyltransferase 2，KMT2）家族成員混合譜系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）蛋白系列催化，MLL 蛋白系列包括MLL1（KMT2A）、MLL2（KMT2B）、MLL3（KMT2C）、MLL4（KMT2D）、MLL5（KMT2E）、SET 結構域蛋白1A（SET domain containing 1A，SET1A，也稱KMT2F）和SET 結構域蛋白1B（SET domain containing 1B，SET1B，也稱KMT2G）以及缺失的、小的、同源異形蛋白1（absent small and homeotic disks protein 1 homolog，ASH1，也稱KMT2H）。H3K4me 受ASXL 轉錄調節因子1（ASXL transcriptional regulator 1，ASXL1）-宿主細胞因子C1（host cell factor C1，HCF1）-O-連接N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶[O-linked N-acetylglucosamine（GlcNAc）transferase，OGT]蛋白復合物調節，參與骨髓髓系祖細胞分化及基因剪接，存在于轉錄基因的啟動子中，已被證明參與造血細胞分化[3]。Wei 等[4]對原發性MDS 患者的骨髓細胞采用染色質免疫共沉淀聯合全基因組測序分析發現，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和先天免疫信號轉導通路涉及的啟動子區域中H3K4me3 高度活化，證實H3K4me3通過介導NF-κB 和先天免疫相關基因的表達參與MDS 發生。對H3K4 甲基化修飾酶進行分析發現，MDS 患者體內11 號染色體長臂2 區3 帶易位區域存在MLL基因及其側翼區域缺失，使用單核苷酸多態性陣列對細胞核型進行檢測發現，MLL1基因串聯復制提示預后不良[5-8]。同時，研究發現，在MLL3 催化失活的工程小鼠模型中，造血細胞分化受到抑制，其向粒細胞/巨噬細胞譜系發生顯著轉變，并表現出骨髓浸潤和次級淋巴器官擴大現象，7 號染色體缺失或長臂缺失是MDS 患者常見的染色體異常，其中q36.1 是7 號染色體長臂中一個關鍵的缺失片段，囊括了編碼MLL3 和MLL5 的基因[9]。有趣的是，敲低17 號染色體上的腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）基因后，骨髓細胞中的MLL3 和神經纖維蛋白1 會在小鼠中誘導AML表型[10]。此外，MLL1基因重排與兒童及成人白血病有關。進一步對其組蛋白去甲基化酶全基因組芯片測序分析發現，組蛋白去甲基化酶含Jumonji結構域3（jumonji domain containing 3，JMJD3，也稱KDM6b）過表達能夠明顯激活固有免疫，使小鼠具有MDS 表型[11]。組蛋白去甲基化酶LSD1 位于包含REST 輔抑制因子1（REST corepressor 1，COREST）、組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）和組蛋白脫乙酰酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）的轉錄抑制復合物中，其具有去除H3K4me、H3K4me2 活性，抑制COREST 和LSD1 表達，阻斷紅細胞、巨核細胞、粒細胞及造血祖細胞分化的作用。LSD1 在MDS 患者中的表達水平明顯高于健康者，抑制LSD1 的表達能夠激活沉默的表觀遺傳基因或導致MDS 細胞凋亡。Sugino 等[12]研究發現，LSD1 抑制劑能夠通過激活超級增強子改善MDS 相關的復雜核型。

1.2 組蛋白3 賴氨酸9（lysine 9 of histone 3，H3K9）甲基化

H3K9 甲基化是轉錄沉默的一個非常保守的標志，可發生單甲基化（H3K9me）、雙甲基化（H3K9me2）及三甲基化（H3K9me3），由賴氨酸甲基轉移酶1（lysine methyltransferase 1，KMT1）家族成員花斑3-9 抑制因子同源物1（suppressor of variegation 3-9 homolog 1，SUV39H1，也稱KMT1A）、花斑3-9 抑制因子同源物2（suppressor of variegation 3-9 homolog 2，SUV39H2，也稱KMT1B）、常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2（euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2，EHMT2，也稱G9A、KMT1C）、常染色質組蛋白甲基轉移酶1（euchromatic histone methyltransferase 1，EHMT1，也稱GLP、KMT1D）、SET 結構域分叉組蛋白賴氨酸甲基轉移酶1（SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1，也稱ESET、KMT1E）以及視網膜母細胞瘤蛋白結合鋅指蛋白（retinoblastoma protein-binding zinc finger protein，RIZ，也稱KMT8）等催化。原癌基因親嗜性病毒整合位點1（ecotropic viral integration site 1，EVI1）異常激活可導致MDS 發生，其可與SUV39H1 及G9A 相互作用，且與骨髓發育不良密切相關[13]。SETDB1 通過調控H3K9me 水平抑制非造血基因異位激活，這對于維持造血干細胞/祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）數量至關重要。SETDB1 缺失可造成內源逆轉錄病毒（endogenous retrovirus，ERV）活化，引起HSPC 中的非造血基因異位激活，從而導致HSPC 快速消耗。Ropa 等[14]研究發現，SETDB1 缺失能夠導致正常骨髓細胞轉化為具有AML 特征的腫瘤細胞，而腫瘤細胞中SETDB1 缺乏及H3K9 甲基化減少會解除對ERV 的沉默作用，繼而引發細胞死亡。H3K9me 也可通過與H3 和H4 乙酰化相關蛋白相互作用影響基因轉錄。武立鵬[15]的研究發現，曾被用于治療MDS 及AML 的組蛋白去乙酰化酶抑制劑縮酚酸肽（depsipeptide）可引起G9A 和SUV39H1 表達下調，進一步導致靶基因啟動子區附近H3K9me2/3 水平下降，使結合在該區域的異染色質蛋白數量減少，從而導致該區域的DNA 甲基轉移酶募集減少，DNA 甲基化水平下降，發揮治療作用。

2 組蛋白乙酰化與MDS

組蛋白乙酰化主要發生在H3 或H4 的N 端比較保守的賴氨酸位置，不僅與基因轉錄有關，還影響DNA 復制和修復。組蛋白乙酰化作用是指組蛋白乙酰化轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）通過使組蛋白賴氨酸殘基乙酰化，中和組蛋白電荷，弱化與DNA 的相互作用，進而疏松染色質結構，為招募轉錄因子提供錨定位點，最終激活基因轉錄；反之HDAC 使組蛋白去乙酰化，抑制基因轉錄。

2.1 組蛋白3 賴氨酸9 乙酰化（lysine 9 of histone 3 acetylation，H3K9ac）

H3K9ac 水平由多種乙酰化酶調節，其中Ⅰ類HDAC1 和Ⅱ類HDAC2 發揮了重要的調節作用，HDAC1 在難治性AML 患者和耐藥AML 細胞中的表達顯著上調[16]。轉錄抑制因子獨立生長因子1（growth factor independent 1，GFI1）及其變異體GFI1-36N 負責將HDAC1 和HDAC2 招募到腫瘤基因位點上，導致H3K9ac 減少，反之則引起H3K9ac增加[17]。MDS 患者中GFI1 和GFI1-36N 低表達，有研究將核孔蛋白98（nucleoporin 98，NUP98）-同源盒D13（homeobox D13，HOXD13）轉基因MDS/AML小鼠模型與GFI1-WT、GFI1-KD 或GFI1-36N 小鼠雜交，發現GFI1-KD 或GFI1-36N 低表達的小鼠H3K9ac 水平增加，而HAT 抑制劑的使用阻礙了細胞生長，解釋了H3K9ac 促進AML 發展的原因[18]。HDAC1 抑制劑伏立諾他（SAHA）被證明對惡性血液腫瘤細胞具有潛在的抑制作用，已通過美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證，并在臨床上廣泛應用。誘導細胞凋亡是目前臨床治療MDS 的重要途徑之一，SAHA 能夠顯著增加MDS 細胞系SKM-1 內H3K9ac 水平，且隨著劑量的遞增，細胞周期縮短且細胞凋亡增加[19-20]。另有研究發現，與健康者相比，高危組MDS 患者骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）中NF-κB 活化水平及抗凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia- 2，Bcl-2）表達水平均升高，細胞凋亡率降低，而HDAC 抑制劑能夠顯著增加BMMNC 凋亡水平，其原因可能與H3K9ac 水平改變有關[21-23]。

2.2 組蛋白4 賴氨酸16 乙酰化（lysine 16 of histone 4 acetylation，H4K16ac）

Zeng 等[24]對不同危險分層的MDS 患者骨髓CD34+細胞中H4 乙酰化水平及其調節酶HAT、HDAC 活性進行檢測，結果發現，中低危MDS 患者骨髓CD34+細胞H4 乙酰化、HAT 水平均高于健康者及高危MDS 患者，而HDAC 活性低于高危MDS患者，表明H4 乙酰化參與了MDS 的發生發展過程。 另有研究發現，MDS 患者BMMNC 中H4K16ac 水平低于健康者[25-26]。沙利度胺是臨床上改善中低危MDS 患者貧血的主要藥物。Aerbajinai 等[27]應用沙利度胺處理MDS 患者原代骨髓CD34+細胞48 h，結果發現，其增加了組蛋白H4 乙酰化，提高了活性氧水平，并激活了p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路；應用抗氧化酶過氧化氫酶和細胞內羥基清除劑二甲基硫脲預處理細胞，消除了沙利度胺誘導的p38 MAPK 活化、組蛋白H4 乙酰化及γ-珠蛋白表達，表明H4 乙酰化、活性氧和γ-珠蛋白水平增加及p38 MAPK 信號通路激活是沙利度胺調控紅細胞分化過程的重要機制。

3 組蛋白泛素化與MDS

哺乳動物組蛋白泛素化位點位于組蛋白2A（histone 2A，H2A）氨基末端K119 殘基和組蛋白2B（histone 2B，H2B）羧基末端K120 殘基。H2A 賴氨酸119 泛素化（ubiquitination of H2A lysine 119，H2AK119ub）大量富集在不活躍的近著絲粒區、失活的X 染色體和沉默的發育基因區域，主要由泛素化酶環指蛋白1A（ring finger protein 1A，RNF1，也稱RING1A）、Cbl 及去泛素化酶泛素特異性肽酶16（ubiquitin specific peptidase 16，USP16）、MYSM1等共同調節，在造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）增殖和分化過程中發揮重要作用。H2B賴氨酸120 泛素化（ubiquitination of H2B lysine 120，H2BK120ub）由特異性泛素連接酶環指蛋白20（ring finger protein 20，RNF20）調控，并不是轉錄所必需的，而是在調節核小體動力學、DNA 損傷反應和其他組蛋白修飾酶活性等過程中發揮特殊作用。有研究表明，ubH2A、ubH2B 能夠使組蛋白3賴氨酸79（lysine 79 of histone 3，H3K79）、H3K4 甲基化增加或聚集，進而阻止蛋白質與常染色質活躍的區域結合，導致基因沉默[28]。

3.1 H2A 泛素化

RING1A 是ubH2A 連接酶多梳抑制復合體1的關鍵成分，在CD34+骨髓祖細胞及高危MDS 患者中過表達，原代CD34+細胞中其失活增強了紅系分化，應用RING1A 抑制劑能夠降低MDS 患者和健康者中CD34+細胞的集落形成能力，表明其在MDS 紅系發育缺陷中發揮作用[29]。MDS 患者骨髓HSC 和祖細胞的芯片和RNA 測序結果表明，H2A去泛素化（anti-ubiquitination of H2A，Anti-ubH2A）連接酶之一USP16 可與許多重要的造血調節因子結合，敲除USP16靶點和調控基因——細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）的表達，改變了HSC的細胞周期和分化缺陷，表明USP16缺失改變了轉錄/染色體組織、免疫反應、造血/淋巴器官發育和骨髓/白細胞分化中基因的表達，盡管不會改變HSC 的數量，但引起成熟細胞和祖細胞數量顯著減少[30]。另外一個Anti-ubH2A 連接酶MYSM1 是調控B 細胞分化和功能的重要分子[31]。MYSM1缺陷型純合子小鼠中脾細胞、骨髓細胞數量均少于同源野生型小鼠及雜合子小鼠，并伴有血小板中度增多和貧血[32-33]。同時，有研究表明，MYSM1 對維持HSC 的靜息狀態具有非常重要的作用，其缺陷可引起靜息態的HSC 大量進入S 期，導致異常增殖的HSC 凋亡增加，并最終引起HSC 和骨髓細胞總數減少[34]。遺憾的是，目前并無H2A 與MDS發病直接相關的證據。

3.2 H2B 泛素化

MLL-AF9 和神經母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog，NRAS）G12D 共同驅動的基因工程AML 小鼠模型驗證了RNF20是MLL-AF9 白血病生長所必需的基因之一；攜帶MLL重排的人類白血病細胞系的增殖也依賴于RNF20；轉錄組測序分析結果表明，在RNF20 受到抑制時，MLL-AF9轉錄靶標表達下調，包括同源盒A9（homeobox A9，HOXA9）、同源盒A10（homeobox A10，HOXA10）、Meis 同源盒1（Meis homeobox 1，MEIS1）和心肌細胞增強因子2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C），表現效果類似于抑制類端粒沉默干擾體1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L）；抑制RNF20 的表達或消除整體ubH2B 同樣能夠使白血病細胞停滯在細胞周期的G1/G0階段，誘發MDS/AML 表型腫瘤細胞，以上證據表明RNF20 是AML 發生的染色質調節因子[35-36]。核小體上ubH2B 可增強H3K4 和H3K79 相關甲基轉移酶的催化活性，研究發現RNF20 在MLL融合靶基因共轉錄區域富集，引發甲基轉移酶DOT1L 介導的H3K79 甲基化在HOXA9 和MEIS1 處聚集，從而使白血病細胞依賴RNF20 來維持其致癌轉錄程序[37]。

4 組蛋白其他修飾與MDS

組蛋白的修飾方式還包括磷酸化、類泛素化、二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等，其研究主要集中于實體腫瘤，在血液腫瘤乃至HSC 惡性克隆演變過程中的作用目前鮮有文獻提及。組蛋白磷酸化具有修復DNA 損傷、介導基因轉錄和染色質凝集等多方面功能。喬婷婷等[38]研究證實，H2A 磷酸化作用參與白血病細胞誘導自然殺傷（natural killer cell，NK）細胞的凋亡過程。雙泛素化/類泛素化連接酶TOP1 結合精氨酸/絲氨酸富蛋白（TOP1 binding arginine/serine rich protein，TOPORS）的缺失通過調節DNA 損傷反應導致小鼠遺傳不穩定和惡性腫瘤發生率增加[39]。有研究采用全基因組測序技術發現，靶向TOPORS 可使MDS 和AML 細胞易發生DNA 損傷缺陷，并提高腫瘤細胞對阿扎胞苷的敏感性，表明去甲基化劑和類泛素化抑制劑之間具有協同作用[40]。二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等組蛋白修飾主要與腫瘤細胞的增殖、凋亡等過程密切相關，現階段相關研究較少。

5 小結與展望

特定的組蛋白修飾能夠使MDS 的組蛋白密碼發生改變，使其與核DNA 結合區由緊變松，靶基因暴露并與轉錄復合物發生作用，從而調控核基因轉錄進程及染色體相關事件[41-42]。有研究報道，編碼表觀遺傳修飾蛋白的基因在70%以上的MDS 患者中發生突變，基因突變導致參與催化組蛋白修飾過程的相關轉移酶的生成或結構異常，間接引起細胞組蛋白修飾水平改變[43]。但截至目前，關于MDS組蛋白的研究主要集中在甲基化及乙酰化層面，血液系統中關于組蛋白泛素化的研究僅限于HSC，與磷酸化、類泛素化、二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等有關的文獻屈指可數，相信對組蛋白密碼的研究將為MDS 發病機制研究、臨床診斷、分期、預后評估、復發評估、療效評價等提供更加有力的證據。

此外，組蛋白密碼在MDS 中值得深入研究，其是一個復雜巨大的調節網絡，不僅是時間維度的單個組蛋白修飾與疾病之間關系的研究，各種修飾之間既存在協同和級聯效應，又互相拮抗，包括組蛋白相同殘基修飾之間的調節、不同組蛋白或不同殘基修飾之間的調節，甚至是多個疾病進程、多維度的多個組蛋白、多個殘基的排列組合[44-45]。但迄今為止，放眼腫瘤研究及其他疾病研究領域中關于以相關修飾酶為靶標的組蛋白修飾機制，特別是組蛋白修飾間調節的相關報道，還不是很具體，且機制還不太清楚，更少涉及逆轉已被修飾的組蛋白的研究，該原因可能與組學技術及相關技術發展和普及程度有限有關。因此，闡明組蛋白修飾調節機制任重道遠。