黃芩素脂質聚合物納米粒對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

吳 萌,李祥平,項 艷

0 引言

心肌缺血造成的心肌供養平衡失調易引起缺血部位心肌功能、形態及代謝等方面的損傷[1]。目前,再灌注是治療心肌缺血損傷的常用措施,但其可導致心肌組織進一步損傷,即引起心肌缺血再灌注損傷[2]。一般心血管器質性病變、器官移植、心血管手術等也會引起心肌缺血再灌注損傷[3]。因此,有效保護心肌缺血后再灌注損傷具有一定的臨床價值。

黃芩素(Baicalein,Bai)是當前研究比較廣泛的黃酮類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等藥理作用[4]。此外,Bai能有效降低腦血管阻力,改善血液循環,對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[5-6],具有一定的臨床應用價值。脂質聚合物納米粒(Lipid-polymer nanoparticles,LPNs)是一種新型納米給藥系統,相較于傳統的脂質體和納米粒給藥載體,LPNs具有更優良的生物相容性和較高的載藥量,具有一定的應用前景[7]。TAT穿膜肽是人工合成的短鏈多肽,具有易穿透細胞膜的生物特性[8]。本研究通過構建TAT短肽修飾的載Bai脂質聚合物納米粒(Bai-TAT-LPNs),觀察其對心肌缺血再灌注大鼠的作用及其機制,為Bai的臨床應用提供基礎理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠40只,體重(180±15)g,購自北京Charles River公司[生產許可證號:SCXK(京)2016-0006]。實驗動物以每籠3～4只飼養于屏障環境中,自由飲水攝食。環境條件:12 h光照/12 h黑暗,溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%。本研究通過麗水市中醫院倫理委員會批準,批準文號:20211125。

1.1.2 主要試劑 黃芩素(產品編號:DH0024,批號:L190321)購自成都德思特公司,以二甲基亞砜配制母液;TAT短肽購自北京澤溪源公司;TUNEL染色試劑盒購自武漢普健公司;caspase 3、Bcl-2、p-AKT、Akt抗體購自美國CST公司;GAPDH抗體和抗兔IgG-HRP二抗購自上海愛必信公司;CK、LDH、MDA和SOD試劑盒購自南京建成公司。

1.1.3 主要儀器 SpectraMax 190酶標儀(美國Molecular Devices公司);JEOL JEM-2100F場發射透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);BX53熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);多導多道生理記錄儀(美國Mindware公司);NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國Malvern公司);AI600凝膠成像儀(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 Bai-TAT-LPNs的制備 取50 mg合成磷脂加至0.5 ml無水乙醇中溶解,將溶液加入40 ml去離子水中攪拌制成水相備用。各稱取120 mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物和10 mg Bai,將二者加入20 ml乙腈溶解后制成油相。隨后將油相與水相混勻,并以旋轉蒸發儀除去乙腈。用0.8 μm微孔濾膜過濾油相和水相混合物獲得LPNs。向LPNs中加入1 ml TAT,并于4 ℃旋轉孵育10 h,次日除去未結合的TAT,獲得Bai-TAT-LPNs。

1.2.2 構建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型、大鼠分組及給藥 隨機選取30只大鼠,手術分離冠狀動脈左前降支,穿線結扎30 min,隨后松開灌注2 h,建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。將模型大鼠隨機分為模型組、Bai組和Bai-TAT-LPNs組,以未結扎的大鼠設為假手術組,每組10只。Bai組和Bai-TAT-LPNs組在缺血前4 h分別腹腔注射Bai(100 mg/kg)和Bai-TAT-LPNs(含Bai 100 mg/kg)的生理鹽水溶液,模型組和假手術組注射等量二甲基亞砜的生理鹽水。

1.2.3 血流動力學和生物指標檢測 以多導多道生理記錄儀檢測血流動力學變化,記錄左心室發展壓(LVDP)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。實驗結束后,取心肌組織,以血生化儀檢測肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平,取血清檢測丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

1.2.4 TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡情況 切取冠脈左前降支結扎部位心臟組織,10%中性福爾馬林固定,參考文獻進行TUNEL染色[2]。組織經石蠟包埋制成切片,切片經脫蠟、水化及蛋白酶K修復等步驟后,行TUNEL染色和DAPI染色,切片脫水后用抗熒光淬滅封片膠封片,于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄各組心肌細胞凋亡情況。計數凋亡細胞和總細胞數,計算凋亡指數。

1.2.5 蛋白印記實驗檢測心肌各蛋白表達變化 參考文獻方法進行蛋白印記實驗[6]。切取冠脈左前降支結扎部位心臟組織0.5 g左右,冰上勻漿并以600 μl組織裂解液裂解,12 000轉/min離心20 min。吸取上清液備用,蛋白定量并制備蛋白樣品。進行SDS-PAGE電泳,上樣量為30 μg/10 μl,將蛋白從凝膠轉印至PVDF膜上,封閉過夜。次日孵育caspase 3抗體(1∶2 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)、Akt抗體(1∶2 000)、p-Akt抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶3 000)4 h。洗膜后孵育相應二抗(1∶5 000)1 h,以ECL發光試劑盒于凝膠成像儀進行成像并分析。

2 結果

2.1 Bai-TAT-LPNs的表征 如圖1所示,構建的Bai-TAT-LPNs在透射電鏡下呈均一的球形,平均粒徑為(127±2.6) nm,粒徑分布較窄。

圖1 Bai-TAT-LPNs表面形態

2.2 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心臟功能指標 生理記錄儀結果如表1所示,相較于假手術組,模型組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標均顯著降低(P<0.01);與模型組相比,Bai組和Bai-TAT-LPNs組大鼠上述3個指標均明顯升高(P<0.05);而Bai-TAT-LPNs組對上述3個指標的改善優于Bai組,差異具有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血流動力學參數(n=10)

2.3 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心肌能量代謝和氧化損傷 如表2所示,相較于假手術組,模型組大鼠血清LDH、CK、MDA明顯高于假手術組,而SOD明顯低于假手術組,差異具有統計學意義(P<0.01);相較于模型組,Bai組和Bai-TAT-LPNs組LDH、CK、MDA明顯降低,SOD顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于Bai組,Bai-TAT-LPNs組LDH、CK、MDA顯著降低,SOD明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD水平變化(n=10)

2.4 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心肌細胞凋亡 如圖2,TUNEL染色結果顯示,假手術組、模型組、Bai組、Bai-TAT-LPNs組凋亡細胞百分比分別為1.01%±0.12%、20.36%±1.98%、13.55%±1.36%、5.25%±0.50%。模型組心肌細胞凋亡百分比高于假手術組,差異具有統計學意義(P<0.01);而Bai組和Bai-TAT-LPNs組心肌細胞凋亡百分比低于模型組,差異具有統計學意義(P<0.01);Bai組與Bai-TAT-LPNs組相比,后者心肌細胞凋亡明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況(20×)

2.5 Bai-TAT-LPNs抑制cleaved-caspase 3、Bcl-2和p-Akt蛋白表達變化 如圖3,蛋白印記結果顯示,相較于假手術組,模型組cleaved-caspase 3蛋白表達明顯上調,Bcl-2和p-Akt/Akt蛋白表達顯著下調,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組相比,Bai組和Bai-TAT-LPNs組cleaved-caspase 3、Bcl-2和p-Akt/Akt蛋白表達變化被抑制,差異具有統計學意義(P<0.01)。其中Bai-TAT-LPNs組的抑制效果更明顯,差異具有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

再灌注雖然可治療心肌缺血損傷,但也可導致心肌組織進一步受損,即引起心肌缺血再灌注損傷[9-10]。通常,心肌缺血再灌注伴隨著心臟功能變化、代謝異常以及心肌細胞凋亡[2,11-13]。本研究構建的心肌缺血再灌注模型大鼠心肌細胞凋亡增加,LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標明顯下降,并伴隨著血清LDH、CK顯著升高,提示心肌缺血再灌注損傷模型大鼠構建成功。

本研究構建TAT短肽修飾的Bai-TAT-LPNs,檢測表征發現其可用于實驗。進一步研究發現,Bai和Bai-TAT-LPNs均能抑制模型大鼠心肌細胞凋亡,以及上述心臟功能和心肌能量代謝指標變化,且Bai-TAT-LPNs作用更明顯。提示Bai-TAT-LPNs對心肌缺血再灌注損傷具有顯著的療效。通常心肌缺血再灌注可引起細胞氧化自由基升高。文獻報道,心肌缺血再灌注過程通常會產生大量的氧自由基及其降解產物,而當內源性自由基清除物無法清除過多的氧自由基時,即可誘導細胞膜脂質過氧化,造成氧化損傷[14-17]。在本研究中,模型大鼠血清氧自由基降解產物MDA增加,而內源性自由基清除物SOD減少,這與文獻報道相類似。Bai和Bai-TAT-LPNs治療可抑制MDA和SOD的變化,且Bai-TAT-LPNs的治療作用更強,提示Bai-TAT-LPNs能顯著減輕心肌缺血再灌注引起的氧化損傷。蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)是細胞內重要的信號分子,可參與調控細胞增殖、凋亡以及糖代謝等生物學過程。已有研究證明,激活Akt信號可對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用[18-20]。在本研究中,心肌缺血再灌注損傷模型大鼠p-Akt/Akt下調,而Bai和Bai-TAT-LPNs均能抑制其表達下調,且Bai-TAT-LPNs作用更顯著。提示Bai-TAT-LPNs可通過激活心肌細胞Akt磷酸化來抵抗心肌缺血再灌注損傷。

LPNs具有更優良的生物相容性、較高的載藥量和生物可降解等優勢[7]。而TAT穿膜肽具有較強的穿透細胞膜能力[8]。本研究構建的Bai-TAT-LPNs對心肌缺血再灌注損傷,較Bai具有更好的療效,這可能與上述作用有關。總之,Bai-TAT-LPNs可改善大鼠心肌缺血再灌注損傷,且效果優于Bai,該作用可能與增強穿膜作用、減輕氧化損傷和激活Akt信號有關。