枸杞多糖對心肌梗死大鼠心肌肌鈣蛋白I表達(dá)及心臟微血管的影響

李會賢， 張愛愛， 張亞維， 陳偉廣， 馬驍

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北張家口 075000；2.張家口市衛(wèi)生健康委員會，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院住院處，河北張家口 075000）

心肌梗死（myocardial infarction）是臨床常見的心血管疾病，是慢性心力衰竭的主要原因，最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，其已經(jīng)成為全球非傳染性疾病患者死亡的首位原因[1]。目前，臨床治療心肌梗死的方法主要為溶栓、冠脈搭橋術(shù)或西藥等西醫(yī)治療方式，但治療效果并不理想，因此探尋一種有效的治療方法是臨床亟待解決的問題[2]。從中草藥中尋找心臟保護(hù)的有效藥物一直備受關(guān)注。枸杞多糖是常見中藥枸杞子（為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實(shí)）的主要藥用成分，在降脂降糖、降血壓、抗氧化、提高免疫力、抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，且已被證實(shí)具有保護(hù)心臟的作用[3-4]，但其作用機(jī)制尚不完全明確。

心肌梗死為急性心肌缺血壞死，心臟微血管損傷是導(dǎo)致其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，心臟微血管損傷會導(dǎo)致心肌細(xì)胞供給不足，進(jìn)而造成局部急性血栓形成，從而引起心肌梗死[5-6]。改善心臟微血管功能，保護(hù)其不受損傷成為治療心肌梗死的有效切入點(diǎn)。另外，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）是心肌收縮的重要裝置之一。近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)，cTnI在心肌受損后血清濃度顯著升高，且持續(xù)時間長，為反映心肌損傷及心肌細(xì)胞壞死的重要標(biāo)志物，特異度及敏感性均較高，被廣泛用于臨床研究監(jiān)測。因此，本研究構(gòu)建心肌梗死大鼠模型，觀察枸杞多糖對心肌梗死大鼠cTnI 表達(dá)及心臟微血管的影響，探討枸杞多糖的心臟保護(hù)作用，以期為其臨床治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物50只SPF級雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量230 ~ 290 g，購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0001，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0034。實(shí)驗(yàn)動物方案已獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理協(xié)會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：201703-22）。按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1. 2 藥物、試劑與儀器枸杞多糖（分子式：C11H22O11，分子量：286.31，純度：99.8%，北京康瑞納有限公司生產(chǎn)，批號：A2721）；氯沙坦鉀片（上海晅科有限公司，批號：XKB3693）。蘇木素染液（北京百奧萊博有限公司）；伊紅染液（北京博沃爾斯有限公司）；cTnI、一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科有限公司）；兔抗cTnI 抗體（深圳市安提有限公司）；兔抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（武漢益普有限公司）；兔抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子1（PECAM-1）抗體（深圳豪地華拓有限公司）；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（深圳豪地華拓有限公司）。MyLab 型大小鼠便攜式彩色多普勒超聲成像儀（上海玉研有限公司）；CX-60 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；HSA-M1812 型酶標(biāo)儀（深圳海思安有限公司）。

1. 3 心肌梗死模型構(gòu)建[2]隨機(jī)選取40 只大鼠，固定后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉，常規(guī)備皮、消毒后，連接好呼吸機(jī)、監(jiān)護(hù)儀，然后充分暴露心臟，剪開心包膜，找到左冠狀動脈前支并結(jié)扎。術(shù)畢閉合胸腔，逐層縫合后，皮下注射8 U/kg青霉素，心電圖繼續(xù)監(jiān)測6 h，若ST段上抬到弓背向上，則視為建模成功。建模過程中3只大鼠死亡，其余37只均建模成功。

1.4 分組與給藥選取建模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、氯沙坦組、枸杞多糖組，每組10 只，取剩余10只健康大鼠作為正常組。建模成功后2 h，氯沙坦組灌胃20 mg/kg 氯沙坦生理鹽水混懸液[4]，對枸杞多糖組灌胃120 mg/kg 的枸杞多糖生理鹽水混懸液[8]，每日1 次，治療28 d。正常組、模型組同期灌胃同體積生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 心肌功能監(jiān)測 采用心臟彩超檢查大鼠心功能，包括左室收縮末期內(nèi)徑（LVSD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、室間隔（IVS）、左心室勞損（LVS）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），各項(xiàng)數(shù)值均經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后獲得。

1.5.2 心臟微血管密度檢測 心肌功能監(jiān)測完成后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉處死大鼠，然后由頸靜脈將凝膠墨汁染色液注入心臟檢測微血管密度。

1. 5. 3 HE 染色法觀察心肌組織病理學(xué)形態(tài) 取各組大鼠心肌組織，制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水后，蘇木素染色5 min。蒸餾水洗滌后，1%鹽酸酒精分化30 s，0.2%氨水中返藍(lán)2 min，蒸餾水洗滌，伊紅染色10 min。去除多余染液，進(jìn)行脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片處理，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)。

1.5.4 ELISA法檢測血清cTnI、NO含量 取各組大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀于405 nm 波長處檢測吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cTnI、NO含量。

1. 5. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌組織cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表達(dá) 取各組大鼠心肌組織，加入400 μL RIPA 和4 μL 蛋白酶抑制劑，勻漿機(jī)勻漿后，冰盒上裂解40 min，離心并取上清液。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，取100 μg 等量蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后，半干法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h。洗膜，加入稀釋的cTnI、eNOS、PECAM-1（1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。洗膜，加入稀釋的二抗（1∶5 000），室溫輕搖孵育30 min。化學(xué)發(fā)光顯影、定影、拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，計(jì)算與GAPDH 的比值求得cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌功能相關(guān)指標(biāo)比較表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組LVSD、LVDD、IVS、LVS 均顯著升高（P＜0.05），LVEF 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組、氯沙坦組大鼠LVSD、LVDD、IVS、LVS 均顯著降低（P＜0.05），LVEF 顯著升高（P＜0.05），且枸杞多糖組的改善效果優(yōu)于氯沙坦組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌功能相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of myocardial function-related indexes among each group of rats（±s）

表1 各組大鼠心肌功能相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of myocardial function-related indexes among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與氯沙坦組比較

?

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較圖1 結(jié)果顯示：正常組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞排列清晰整齊，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組心肌組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，心肌纖維斷裂，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，枸杞多糖組、氯沙坦組病理結(jié)構(gòu)明顯改善，胞漿橫紋清晰，炎癥細(xì)胞明顯減少。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological morphology of myocardium among each group of rats（HE staining，×200）

2.3 各組大鼠血清cTnI、NO含量比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清NO含量顯著降低（P＜0.05），cTnI 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組、氯沙坦組血清NO含量顯著升高（P＜0.05），cTnI 含量顯著降低（P＜0.05），且枸杞多糖組的改善效果優(yōu)于氯沙坦組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清cTnI、NO含量比較Table 2 Comparison of serum cTnI and NO levels among each group of rats（±s）

表2 各組大鼠血清cTnI、NO含量比較Table 2 Comparison of serum cTnI and NO levels among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與氯沙坦組比較

?

2.4 各組大鼠心臟微血管密度比較正常組、模型組、氯沙坦組、枸杞多糖組心臟微血管密度分別為（289.54 ± 16.44）（110.65 ± 5.33）（195.92 ±9.07）（226.36±12.51）（F=32.730，P＜0.001）。與正常組比較，模型組大鼠心臟微血管密度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組、氯沙坦組心臟微血管密度顯著升高（P＜0.05），且枸杞多糖組的改善效果優(yōu)于氯沙坦組（P＜0.05）。心臟微血管分布見圖2。

圖2 各組大鼠微血管分布比較（×200）Figure 2 Comparison of microvessel distribution among each group of rats（×200）

2. 5 各組大鼠心肌組織cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表達(dá)比較表3、圖3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌組織cTnI 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），eNOS、PECAM-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組、氯沙坦組心肌組織cTnI 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），eNOS、PECAM-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且枸杞多糖組的改善效果優(yōu)于氯沙坦組（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織cTnI、eNOS、PECAM-1的Western Blot條帶Figure 3 Western Blot bands of cTnI，eNOS and PECAM-1 in rat myocardial tissue in each group of rats

表3 各組大鼠心肌組織cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expressions of cTnI，eNOS，and PECAM-1 in myocardial tissues among each group of rats（±s）

表3 各組大鼠心肌組織cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expressions of cTnI，eNOS，and PECAM-1 in myocardial tissues among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與氯沙坦組比較

?

3 討論

近年來，隨著人們生活方式及節(jié)奏的日益改變，心肌梗死的患病率呈急劇上升態(tài)勢，據(jù)調(diào)查顯示，我國每年新增心肌梗死人數(shù)高達(dá)60萬[9]。探求心肌梗死發(fā)病的始動因素，防治其發(fā)生、發(fā)展對提高患者生活質(zhì)量及生存具有積極而深遠(yuǎn)的意義[10]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可通過拮抗心肌細(xì)胞凋亡、維持線粒體平衡、抗氧化等作用，修復(fù)心肌細(xì)胞損傷，改善心肌功能，有效治療大鼠心肌缺血再灌注（I/R）、心肌梗死[4，11-12]。本研究結(jié)果亦顯示，枸杞多糖可顯著改善心肌梗死大鼠心肌功能及心肌組織病理形態(tài)，進(jìn)一步證明其對心肌梗死具有顯著療效。氯沙坦是第一個血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物，其可通過抑制缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡，對心肌梗死起到治療作用，是臨床治療心肌梗死的常用藥物，因此，本研究選其作為陽性對照藥物[5，13]。本研究結(jié)果表明，枸杞多糖對心肌梗死大鼠心功能的改善效果優(yōu)于氯沙坦。

cTnI 是僅存在心肌內(nèi)的一種蛋白，定位于肌小節(jié)細(xì)肌絲上，可參與心肌收縮和舒張的調(diào)節(jié)，其在正常人中表達(dá)很少，但受到如炎癥等病理性刺激其水平就會升高[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死早期cTnI 就會釋放入血，且表達(dá)不會受到血液其他因素的影響，同時cTnI 表達(dá)異常可能與心肌梗死后心衰密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，枸杞多糖可顯著降低心肌梗死大鼠血清cTnI 含量，降低心肌組織cTnI 蛋白表達(dá)，表明枸杞多糖可能是通過抑制cTnI 轉(zhuǎn)錄及翻譯，抑制cTnI 釋放入血，進(jìn)而有效改善心肌舒縮功能，改善心肌損傷，最終有效延緩疾病進(jìn)展。

心臟微血管在控制組織循環(huán)流量、收縮功能、組織代謝、節(jié)律控制方面發(fā)揮重要作用，其功能正常是心臟微循環(huán)正常的前提，心臟微循環(huán)損傷是造成心肌梗死發(fā)生、發(fā)展的潛在因素之一[16]。有研究[17]表明，心肌梗死后心臟微血管密度顯著降低，是引起心肌缺血、缺氧、代謝效率降低的主要原因，同時與NO、eNOS一樣也是反映心臟微血管損傷的關(guān)鍵指標(biāo)。而PECAM-1作為免疫球蛋白超家族的重要成員，其在血管生成、信號傳導(dǎo)等血管生物學(xué)方面具有不可或缺的作用，檢測其表達(dá)可有效判斷心臟微血管數(shù)量、功能狀態(tài)以及與疾病的關(guān)系[18]。本研究結(jié)果顯示，枸杞多糖可顯著抑制升高心肌梗死大鼠微血管密度，促進(jìn)NO、eNOS、PECAM-1 表達(dá)，這說明枸杞多糖可顯著改善心臟微血管損傷，對心臟微血管具有一定保護(hù)作用，其可能是通過促進(jìn)心臟微血管生成，進(jìn)而改善心肌缺血、缺氧狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到保護(hù)心臟微血管，改善疾病癥狀的目的。

綜上所述，枸杞多糖可顯著降低心肌梗死大鼠心肌cTnI 水平，改善心臟微血管損傷，對心臟具有一定的保護(hù)作用，且優(yōu)于氯沙坦。