肉桂醛調節AMPK/SREBP1c信號通路對非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝損傷的影響

姚碩， 李源， 段超， 曾艷

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院中西醫結合科，湖北武漢 430077；2.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院血液科，湖北武漢 430077）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）最嚴重的形式，其特征是小葉炎癥、肝細胞膨大和纖維化，是全球肝癌死亡增長最快的原因[1-2]。然而，NASH的發病機制尚未完全闡明，且缺少針對NASH 治療的特效藥物。NASH歸屬于中醫學“肝癖”范疇，以痰濕瘀交阻于肝絡，體內肥濁之氣蓄積于肝臟為病機，化痰祛濕、健脾活血為基本治則[3]。肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥樹皮，味辛、甘，歸肝、腎、脾和心經，具有補元陽、溫脾胃、通血脈的功效。肉桂醛是肉桂的活性成分之一，已被證明是肝臟脂肪變性治療的潛在附加藥物[4]。研究表明，肉桂醛可以調節肝臟的脂質代謝，減少脂質過度積累，以及調節葡萄糖代謝和改善高血糖[5-7]，還具有降血脂、抗氧化和抗炎作用，可減輕高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化[8]；但其對NASH的作用及機制尚不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被認為是肝臟脂質代謝進展的關鍵調節因子。膽固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）是脂肪生成主要調節因子的轉錄因子，可引起甘油三酯（TG）在肝臟中過度積累，導致NAFLD 的發展[9]。AMPK 通過負調控轉錄因子SREBP1 協調脂質代謝的長期適應[10]。激活AMPK 可通過抑制SREBP1 表達對NASH的肝臟發揮保護作用[11]。因此，本研究通過構建NASH 小鼠模型，基于AMPK/SREBP1 通路探討肉桂醛對NASH小鼠肝損傷的治療作用及機制，以期為其臨床治療NASH提供循證依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物96 只SPF 級8 周齡雄性C57/BL6小鼠，體質量（20±2）g，購自成都藥康生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2020-034。將小鼠飼養于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗室，動物使用許可證：SYXK（鄂）2019-0106，飼養條件：濕度（55 ± 5）%、光照12 h/黑暗12 h 循環，期間自由攝食和飲水。所有動物實驗方案已獲得華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院倫理委員會批準（審批號：20210805），并按照《中國實驗動物護理使用指南》和實驗動物管理方法進行。

1.2 藥物、試劑與儀器肉桂醛（分子式：C9H8O，分子量：132.16，結構簡式：C6H5CHCHCHO，純度≥98%，美國Sigma 公司，批號：W228613）。Compound C[AMPK 抑制劑，純度：99.91%，美國MedChemExpress（MCE）公司生產，批號：HY-13418A]；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、TG、總膽固醇（TC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）等檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；油紅O染色試劑盒和Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京百奧曼科技有限公司）；磷酸化AMPK（p-AMPK）、AMPK、磷酸化ACC（p-ACC）、乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶1（CPT1）、SREBP1c、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（Scd1）等抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、FITC標記的山羊抗兔IgG 熒光二抗（英國Abcam 公司）；Hiscript Ⅲ逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；SYBR Green 定量PCR 試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司）。3100 全自動生化分析儀（日本日立公司）；Ts2R 熒光顯微鏡（日本尼康公司）；iMark680 多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置（美國Bio-Rad 公司）；ABI 7500 定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）。

1. 3 分組、建模與給藥將小鼠適應性喂養7 d后，隨機分為正常組和造模組，正常組給予普通飼料喂養，造模組給予高脂飼料（按質量分數配比：78%基礎飼料、15%豬油、1%膽固醇和6%蔗糖，由江蘇省協同生物工程有限責任公司提供）喂養8 周制備NASH 模型[12]。8 周后，隨機從造模組取出6只小鼠，處死后取肝臟制作病理切片，驗證造模成功與否。結果顯示，肝細胞胞質內見大小不一的球形脂滴空泡，且大量肝細胞伴有不同程度的炎癥細胞浸潤，說明模型構建成功[12]。將剩余造模成功的小鼠隨機分為模型組，肉桂醛低、中、高劑量組及肉桂醛高劑量+Compound C組，每組15 只。肉桂醛低、中、高劑量組分別給予灌胃肉桂醛混懸液（0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑）10、20、40 mg/kg[6]，肉桂醛高劑量+Compound C 組給予灌胃40 mg/kg的肉桂醛混懸液及腹腔注射5 μmol/L的Compound C[11]，每日1 次，持續12 周。正常組和模型組同期給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃和生理鹽水腹腔注射。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 生化指標分析 采用斷頸法處死小鼠，取眼球血液，離心后，收集血清。應用ELISA 法檢測AST、ALT、TG、TC 含量，嚴格按照試劑盒說明操作。將肝臟組織裂解、勻漿，以1 000g離心10 min，取上清，應用試劑盒檢測MDA、SOD 和GSH水平。

1.4.2 形態學檢測和NAFLD 評分 HE 染色：收集肝臟組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色。

油紅O 染色：將冰凍切片用甲醛-鈣固定15 min，去離子清洗，浸入60%異丙醇水溶液中，將去離子和油紅以2∶3 混合，室溫下放置10 min。油紅O染色10 min，60%異丙醇水溶液分化，去離子水沖洗，蘇木素復染，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

Masson 染色觀察肝臟纖維化程度。取肝組織石蠟切片（厚5 μm），常規脫蠟至水后，進行Masson 染色，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，置于顯微鏡下進行病理學檢查。

根據HE 染色結果，通過Image ProPlus 計數炎癥病灶以及肝細胞的脂肪變性面積。采用Li等[13]的NAFLD 評分標準，通過計數4 個參數計算每組小鼠的NAFLD 評分，包括大泡脂肪變性、微管脂肪變性、肝細胞肥大和炎癥細胞聚集，結果見表1。NAFLD 評分由2 位經驗豐富的病理學家對切片進行盲評。其中，NAFLD 評分≥5 分，診斷為NASH，評分≤2分，診斷為“非NASH”。

表1 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）評分Table 1 NAFLD scores

1.4.3 Western Blot分析 從肝臟組織中提取總蛋白，并用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白濃度。提取的蛋白進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），并轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）上，5%脫脂牛奶封閉，室溫孵育1 h。加入一抗p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、p-ACC（1∶1 000）、ACC（1∶1 000）、CPT1（1∶500）、SREBP1c（1∶500）、Scd1（1∶1 000），4 ℃過夜。HRP 偶聯的二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h，ECL顯影，并使用ImageJ 軟件檢測蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達水平，以GAPDH 為內參。蛋白相對含量=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值。

1.4.4 免疫熒光檢測 將肝臟切片脫蠟、水化后進行抗原修復。用3%過氧化氫孵育10 min 滅活內源性過氧化物酶，1%山羊血清封閉后，與兔源一抗SREBP1c（1∶200）4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，加入FITC 熒光標記的山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，切片用DAPI 染色5 min，固定。PBS 沖洗，用抗熒光淬滅劑封固后，熒光顯微鏡下成像。

1.4.5 RT-PCR 分析 應用TRIzol 從肝組織提取總RNA，使用Hiscript Ⅲ試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，采用2×SYBR 進行熒光定量PCR，檢測基因表達。反應系統（20 μL）：10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、0.8 μL PCR正向引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL PCR 反向引物（10 μmol·L-1）、2 μL cDNA（200 ng·μL-1）和6.4 μL 無菌水。PCR 反應條件如下：95 ℃、30 s（預變性）；95 ℃、5 s（變性），55 ℃、10 s（退火），72 ℃、15 s（延伸），共計40個循環。采用2-ΔΔCT法檢測目的基因相對表達。引物序列見表2。所有引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。

表2 PCR引物序列Table 2 PCR primers sequence

1.5 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據的統計分析，以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清生化指標水平比較表3 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠ALT、AST、TG、TC 水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組小鼠ALT、AST、TG、TC水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C組ALT、AST、TG、TC水平顯著增加（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清生化指標水平比較Table 3 Comparison of blood biochemical levels among each group of mice（±s）

表3 各組小鼠血清生化指標水平比較Table 3 Comparison of blood biochemical levels among each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與肉桂醛低劑量組比較；④P＜0.05，與肉桂醛中劑量組比較；⑤P＜0.05，與肉桂醛高劑量組比較

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2.2 各組小鼠肝組織中氧化應激指標水平比較表4結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組MDA 水平顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH 水平顯著升高，且呈劑量依賴性；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C 組MDA 水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH水平比較Table 4 Comparison of MDA，SOD and GSH levels in liver tissues among each group of mice（±s）

表4 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH水平比較Table 4 Comparison of MDA，SOD and GSH levels in liver tissues among each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與肉桂醛低劑量組比較；④P＜0.05，與肉桂醛中劑量組比較；⑤P＜0.05，與肉桂醛高劑量組比較

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2.3 各組小鼠肝組織形態學檢測和NAFLD 評分比較HE 染色和油紅O 染色觀察到，模型組小鼠肝臟脂肪變性，Masson 染色發現肝臟纖維化。與正常組比較，模型組小鼠肝脂沉積和纖維化顯著增加；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組肝脂沉積和纖維化顯著減少，且呈劑量依賴性；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C組肝脂沉積和纖維化顯著增加。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理表現（×200）Figure 1 Histopathological manifestations of liver tissues in each group of mice（×200）

NAFLD 評分結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠NAFLD評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組小鼠NAFLD 評分顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C 組NAFLD評分顯著增加（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠肝損傷評分比較Table 5 Comparison of liver injury scores among each group of mice（±s）

表5 各組小鼠肝損傷評分比較Table 5 Comparison of liver injury scores among each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與肉桂醛低劑量組比較；④P＜0.05，與肉桂醛中劑量組比較；⑤P＜0.05，與肉桂醛高劑量組比較

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2.4 各組小鼠肝組織p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、 CPT1、 SREBP1c、 Scd1 蛋白表達比較Western Blot 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT1 表達水平顯著降低，SREBP1c、Scd1 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組小鼠p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT1 表達水平顯著升高，SREBP1c、Scd1 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C 組p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT1 表達水平顯著降低，SREBP1c、Scd1表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖2和表6。

圖2 各組小鼠肝組織p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT1、SREBP1c、Scd1蛋白的Western Blot條帶Figure 2 Western Blot bands of p-AMPK，AMPK，p-ACC，ACC，CPT1，SREBP1c and Scd1 proteins in the liver tissues

表6 各組小鼠肝組織p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT1、SREBP1c、Scd1的蛋白相對表達量比較Table 6 Comparison of relative protein expressions of p-AMPK，AMPK，p-ACC，ACC，CPT1，SREBP1c，Scd1 in liver tissues among each group of rats（±s）

表6 各組小鼠肝組織p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT1、SREBP1c、Scd1的蛋白相對表達量比較Table 6 Comparison of relative protein expressions of p-AMPK，AMPK，p-ACC，ACC，CPT1，SREBP1c，Scd1 in liver tissues among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與肉桂醛低劑量組比較；④P＜0.05，與肉桂醛中劑量組比較；⑤P＜0.05，與肉桂醛高劑量組比較

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免疫熒光染色結果顯示：SREBP1c 陽性表達呈綠色。與正常組比較，模型組SREBP1c 陽性細胞顯著增多；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組SREBP1c 陽性細胞顯著減少；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C 組SREBP1c陽性細胞顯著增多。見圖3。

圖3 SREBP1c在各組小鼠肝臟組織中的表達（×200）Figure 3 Expression of SREBP1c in liver tissues of each group of mice（×200）

2.5 各組小鼠肝組織CPT1α、Lcad、ACC1、FAS的mRNA表達水平比較表7結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肝組織CPT1α、Lcad 的mRNA表達水平顯著降低，ACC1、FAS 的mRNA 表達水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低、中、高劑量組小鼠CPT1α、Lcad 的mRNA 表達水平顯著升高，ACC1、FAS 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+Compound C 組CPT1α、Lcad的mRNA表達水平顯著降低，ACC1、FAS的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表7 各組小鼠肝組織CPT1α、Lcad、ACC1、FAS的mRNA表達水平比較Table 7 Comparison of mRNA expression levels of CPT1α，Lcad，ACC1 and FAS in live tissues among each group of rats（±s）

表7 各組小鼠肝組織CPT1α、Lcad、ACC1、FAS的mRNA表達水平比較Table 7 Comparison of mRNA expression levels of CPT1α，Lcad，ACC1 and FAS in live tissues among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與肉桂醛低劑量組比較；④P＜0.05，與肉桂醛中劑量組比較；⑤P＜0.05，與肉桂醛高劑量組比較

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3 討論

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的患病率隨著肥胖和糖尿病的增加而上升[14]。脂質代謝失調是NASH 發生的主要原因之一，脂肪酸和TG 合成增加、代謝減少，導致TG 和TC 在肝臟中堆積過度[15]。相關研究表明，肝臟脂質沉積異常可產生毒性作用，易引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）[16]。此外，NASH 中TG 和TC 含量過高，ALT 和AST 水平升高[17]。本研究中，高脂飼料喂養的小鼠肝臟TG和TC濃度及ALT和AST水平顯著升高。肝臟組織病理性結果顯示，NASH小鼠肝臟脂肪變性，肝脂沉積和纖維化顯著增加，NAFLD 評分顯著升高，表明模型構建成功。本研究中，肉桂醛治療可改善NASH 模型小鼠肝臟脂質積累，降低TG 和TC 濃度及ALT 和AST 水平。提示肉桂醛可減輕肝臟脂肪變性，改善NASH小鼠肝損傷。此外，脂質異常積累引起的氧化應激被認為是NASH發生發展的一個重要起始因素；氧化應激增加能促進脂質過氧化過程，加重肝損傷[18]。本研究中，高脂飼養誘導的NASH 小鼠肝組織中脂質過氧化產物MDA水平升高，自由基清除劑SOD 活性和GSH 水平降低，表明NASH小鼠肝組織中氧化應激增強，而給予肉桂醛干預后，MDA 水平降低，SOD 活性和GSH水平升高，提示肉桂醛可降低NASH小鼠肝組織中氧化應激水平，發揮肝保護作用。

腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一種三聚體蛋白激酶，通過脂質代謝刺激大分子分解產生能量，是機體和細胞能量代謝的主要調節器。研究[19-20]表明，在肝臟組織中，AMPK 的激活可使乙酰輔酶A羧化酶（ACC）磷酸化，降低丙二酰CoA的表達，從而緩解肉毒堿棕櫚酰轉移酶1（CPT1）的抑制，促進脂肪酸氧化，降低血清游離脂肪酸含量，降低脂肪在組織的沉積，改善脂代謝。此外，膽固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）是AMPK下游的關鍵蛋白，是脂質代謝的關鍵調節因子，磷酸化的ACC 又可進一步抑制下游SREBP1 的表達，TG 的合成和代謝受SREBP1 的轉錄調控，SREBP1 與固醇反應元件（SRE）結合后，可激活下游與脂質合成有關的關鍵酶，如脂肪酸合成酶（FAS）、ACC1、硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（Scd1）等，其中ACC 催化乙酰輔酶A 形成丙二酰輔酶A，合成長鏈脂肪酸前體，FAS催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，參與長鏈脂肪酸生成的內源性蛋白酶[21-22]。Scd1 介導肝臟脂質代謝，在NAFLD 患者和高脂飲食誘導的小鼠肝臟中的表達增加，促進肝脂肪變性[23]。激活AMPK減少SREBP1c及其下游的脂肪生成酶，從而改善脂質氧化，并減少膽固醇、TG合成和肝臟中的脂質積累[24]。本研究結果顯示：高脂飼養喂養后，NASH小鼠肝臟中p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT1表達顯著降低，SREBP1c及其下游Scd1 的表達顯著增加；肉桂醛治療后，NASH 小鼠肝臟中p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT1 表達增加，SREBP1c 和Scd1 表達顯著降低，且肉桂醛能減少肝組織細胞核中SREBP1c 陽性表達，抑制核SREBP1c 激活。提示肉桂醛可能通過調控AMPK/SREBP1c通路，影響脂肪酸氧化。

此外，本研究還分析了與脂肪酸代謝密切相關的基因表達情況。ACC1是一種合成ACC合酶的基因，定位于細胞質中，生成的丙二酰CoA 用于脂肪酸合成；FAS 為一種合成脂肪酸的關鍵酶，ACC1 和FAS 用于評估脂肪酸的合成[25]；CPT1α 和長鏈酯酰輔酶A脫氫酶（Lcad）是脂肪酸β氧化的關鍵酶[13]。本研究結果表明，肉桂醛可通過增加ACC1和FAS的mRNA表達，降低CPT1α和Lcad 的mRNA表達，影響脂肪酸代謝。

為明確AMPK/SREBP1c 通路是否參與肉桂醛對NASH小鼠肝組織中脂質積累的影響，本研究在肉桂醛干預的基礎上，使用AMPK/SREBP1c 通路抑制劑Compound C 進行進一步驗證。結果顯示，Compound C 降低了AMPK 及其磷酸化表達，并增強了SREBP1c 及其靶基因的表達，減弱了肉桂醛對NASH 小鼠肝組織的保護作用，證實肉桂醛可能通過激活AMPK、抑制SREBP1c，減輕NASH肝損傷。

綜上所述，肉桂醛可有效減輕NASH小鼠肝損傷，其機制可能與通過調控AMPK/SREBP1c 通路，抑制氧化應激，改善肝臟脂肪變性有關。