通陽寬胸方治療穩定型心絞痛的網絡藥理學機制研究

劉文甜， 梁文堅， 劉鵬， 陳麗芳， 徐槐敏， 李雪嬌

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；2.廣東省第二中院，廣東廣州 510095）

穩定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）的一種亞型。冠心病有不同的轉歸，而其關鍵治療時期在于穩定型心絞痛的防治。目前，SAP治療主要包括三個方面：改變生活方式、藥物治療以及經皮冠狀動脈介入術治療。藥物治療和介入治療確實極大地改善了冠心病患者的病情，但也存在一些臨床問題，例如：硝酸酯類藥物易導致頭痛和低血壓，他汀類藥物可導致肝功能的損害以及支架手術后易發生再狹窄。而中醫治療SAP 具有一定優勢，不但能改善臨床癥狀，還能通過對病理損傷的修復，延緩病程的進展，從而起到防治的效果[1]。

SAP 歸屬于中醫學“胸痹心痛”的范疇。嶺南心血管病溫通學派創始人、全國名老中醫學術繼承指導專家、廣東省名中醫王清海教授提出，冠心病病理基礎具有多虛、多郁、多痰、多瘀四個特點，SAP的基本病機則在于胸陽不振，痰瘀內阻。基于SAP 的病機，王教授提出了通陽宣痹、活血化痰的治法，創制了治療SAP 經驗方——通陽寬胸方，并以院內制劑的形式多年來一直應用于臨床中。前期多項臨床研究[2-3]已證實，通陽寬胸方在治療SAP 方面可提高患者的運動耐量，同時也可緩解SAP 的臨床癥狀，減少心絞痛癥狀發作的次數和急性發作時所需硝酸甘油的使用量，能夠減短發作時間，且不良反應少；前期的動物實驗也已證實，該方不僅能顯著改善MIR 的冠脈循環障礙，對缺血性心肌后再灌注的心肌收縮能產生穩定作用，而且也能阻止冠狀動脈粥樣硬化大鼠血栓重塑，并通過降低總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平而改善高脂狀態，通過降低白細胞介素（IL）-17A、血管細胞黏附因子（VCAM）-1 和細胞間黏附分子（ICAM）-1的表達水平減少炎癥，從而起到減小斑塊體積，合理調節人體脂代謝，增強斑塊的穩定性，以及防止動脈粥樣硬化形成等作用[4]。但通陽寬胸方治療SAP 的活性成分及具體作用機制仍不完全清楚。因此，本研究采用網絡藥理學研究方法探究通陽寬胸方治療SAP 的機制，以期為通陽寬胸方的實驗研究和臨床應用提供更多參考，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 組方活性成分及靶點獲取借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（https://tcmspw.com），以類藥性≥0.18且口服生物利用度≥30%為條件，依次篩選通陽寬胸方中桂枝、薤白、瓜蔞皮、醋延胡索、川芎、醋香附、紅花、陳皮、法半夏、枳實的活性成分，TCMSP 數據庫中沒有收錄的藥物，使用本草組鑒HERB數據庫（http://herb.ac.cn/）篩選活性成分，刪去無靶點的化合物，將得到的通陽寬胸方潛在的活性成分及靶點進行匯總。

1. 2 疾病靶點獲取以“stable angina pectoris”“stable angina”“stable disease angina pectoris”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）、TTD數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、ETCM數據庫（http://www.tcmip.cn/ETCM/）、DrugBank 數據庫（https://go.drugbank.com/）、PhamGkb 數據庫（https://www.pharmgkb.org/）中進行搜索。為避免GeneCards 基因數過多，以score ≥0.90 為條件篩選，獲取SAP疾病靶點。

1.3 疾病與藥物靶點交集及網絡構建通過對通陽寬胸方靶點和SAP 疾病靶點進行Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org）的統一整合和刪除，最終可獲得具有相交集的基因名。通過Venn 圖分析，確定藥物和疾病的共同作用靶點。在此基礎上，在數據庫STRING（https://string-db.org/）中導入共同靶點， 參數設置為“Homo sapiens”“highest confidence=0.900”“hide disconnected nodes in the network”，通過整合和分析，構建藥物-疾病靶點蛋白協同生效的蛋白互作（PPI）網絡圖，以了解靶點蛋白質之間的相互作用機制，深入探究蛋白質在系統中的作用機理。

1.4 富集分析通過R語言軟件中的Bioconductor包進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析以解析藥物疾病交集靶點基因，展示通陽寬胸方在治療SAP中的潛在生物學過程和途徑，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 通陽寬胸方潛在活性成分及相關靶點結果獲得通陽寬胸方中桂枝5 個、薤白9 個、瓜蔞皮9 個、醋延胡索28 個、川芎8 個、醋香附17 個、紅花18個、陳皮4個、法半夏12個、枳實18個有效成分，共有128個有效成分，去除重復后有108個有效成分。共獲得2 539 個靶點，去除重復后有915個。如表1所示。

表1 通陽寬胸方包含的化合物及對應潛在靶標個數Table 1 Compounds contained in Tongyang Kuanxiong Prescription and the number of corresponding potential targets

2.2 SAP疾病靶點和藥物-疾病共同靶點如圖1所示，在ETCM數據庫中得到29個靶點，DrugBank數據庫中得到80 個靶點，TTD 數據庫中得到42 個靶點，PhamGkb數據庫中得到6個靶點，GeneCards數據庫中得到2 598 個靶點，共得到2 755 個疾病靶點，去除重復值后共有2 648個。與通陽寬胸方108個成分對應的915個藥物靶點和SAP的2 648個疾病靶點進行Venn 分析，最終可得出548 個共同靶點。

圖1 穩定型心絞痛（SAP）相關靶點合集（A）與通陽寬胸方和SAP疾病基因交集Venn圖（B）Figure 1 SAP-associated target ensemble（A）and Venn diagram of the intersection of Tongyang Kuanxiong Prescription and SAP disease genes（B）

2.3 藥物-有效成分-靶點網絡模型分析結果將通陽寬胸方治療SAP 的548 個靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化，構建通陽寬胸方與SAP 的藥物-有效成分-靶點網絡，結果如圖2所示，網絡圖共包括666 個接點，4 221 條相互作用關系。其中粉色方形節點代表SAP 和通陽寬胸方共有的靶點，三角形表示通陽寬胸方中的中藥，藍色圓形表示中藥有效成分，餅圖為中藥的共同有效成分。

圖2 通陽寬胸方治療穩定型心絞痛（SAP）的藥物-有效成分-靶點網絡圖Figure 2 Diagram of the drugs-active ingredientstarget networks of Tongyang Kuanxiong Prescription for treatment of SAP

2.4 通陽寬胸方治療SAP 的PPI 網絡將通陽寬胸方干預SAP 的549 個靶點導入STRING 數據庫，利用Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化分析，構建PPI網絡。見圖3。其中顏色越深表示其度（degree）值越大，相關性越高。根據degree 值排序，選擇前30 個靶點作為關鍵靶點，即SRC、TP53、PIK3R1、 AKT1、 STAT3、 HSP90AA1、 MAPK3、MAPK1、 PIK3CA、 CTNNB1、 GRB2、 HRAS、JUN、 RELA、PTPN11、 EGFR、 LCK、 MAPK14、MAPK8、FYN、RAC1、ESR1、RXRA、HDAC1、JAK2、LYN、JAK1、PTK2、STAT1、VEGFA。上述靶點的節點degree 值均大于56，提示這些靶點在通陽寬胸方治療SAP 的網絡中可能發揮重要作用。

圖3 通陽寬胸方治療穩定性心絞痛（SAP）的蛋白-蛋白互作（PPI）網絡圖Figure 3 Protein-protein interactions network diagram of Tongyang Kuanxiong Prescription for treatment of SAP

2.5 富集分析結果及可視化從STRING 中獲取GO條目4 357條，生物學過程（BP）3 772條，細胞組成（CC）203條，分子功能（MF）382條。其中：主要涉及的生物學過程（BP）包括應激反應、細胞增殖、細胞對化學刺激的反應等；細胞組成（CC）主要與囊泡、細胞外間隙、細胞器等相關；分子功能（MF）方面主要與蛋白結合、酶結合、蛋白質催化等功能關聯。以上分析均根據顯著性選取排前20位的條目作圖，具體見圖4。對于潛在的靶點蛋白KEGG通路富集分析，可得到KEGG富集信號通路199 條，根據其顯著性選取排前30 位的通路作圖，結果如圖5所示。與SAP相關的通路主要涉及PI3K-AKT 信號通路、cAMP 信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、細胞凋亡、細胞衰老、HIF-1信號通路等。

圖4 GO分析Figure 4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG分析Figure 5 KEGG enrichment analysis

3 討論

本研究借助網絡藥理學探索了通陽寬胸方治療穩定型心絞痛（SAP）的潛在作用機制。利用TCMSP 進行篩選，確定了與通陽寬胸方相對應的靶點，共有108種主要的活性成分構成了該方的有效成分，其中，β-谷甾醇、川芎咔啉堿、川陳皮素、柚皮素、槲皮素、橙皮素、山柰酚等可能起主要治療作用。研究表明，川芎咔啉堿可顯著地增強冠脈血流量和心臟供給血流量，促進血管內皮細胞（VECs）損傷時的恢復，維護血管壁的光滑、完整性，防止血栓的產生[5]。橙皮素的相關研究結果表明，其能有效調節血脂，對血管內皮細胞具有促生長及增殖遷移作用，可以有效調節一氧化氮（NO）、內皮素1（ET-1）等多種血管活性物質，在血管病理或生理生成中起著重要作用[6]，是反映血管內皮功能的重要細胞因子。相關動物實驗研究[7]表明，β-谷甾醇可以抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠的氧化應激反應和炎癥反應，通過調節相關通路減少細胞凋亡從而減輕心肌損傷。川陳皮素是一種天然的多甲氧基黃酮，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的功效，通過調控PI3K-AKT信號通路，可減輕內質網應激相關的細胞凋亡，從而減輕心肌缺血再灌注損傷[8]；山柰酚可抑制環氧合酶、淋巴因子白細胞介素6（IL-6）、IL-1、IL-18和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的釋放，起到抗炎的保護作用[9]。柚皮素可減少血管壁中脂肪條紋的形成和巨噬細胞浸潤，抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，糾正血脂異常相關的代謝紊亂，發揮抗AS 的作用[10]。研究[11]顯示，脂多糖（LPS）誘導了血管平滑肌細胞中活性氧簇（ROS）生成導致的動脈粥樣硬化，而槲皮素可以激活PI3K-AKT調節的Caspase-3和NF-κB，減少ROS 生成，改善動脈粥樣硬化。β-谷甾醇、川陳皮素、山柰酚、柚皮素及槲皮素均有明顯的抗炎作用，通過抑制炎癥的產生和氧化應激，減少內皮損傷，改善動脈粥樣硬化，阻止SAP 的發生發展。上述藥物活性成分的生物學功效均與SAP 機制相關，因此，推斷這些有效物質聯合作用于SAP，從而發揮治療效果。

通陽寬胸方的有效成分靶點和SAP靶點的PPI排前30 位靶點的功能分析顯示，該方可通過對損傷血管內皮的保護、抑制炎癥的產生和氧化應激等方面發揮對冠心病的治療作用。其中，SRC、TP53、 HSP90AA1、 STAT3、 MAPK3、 AKT1、VEGFA等7個靶點在該方預防SAP發病和治療SAP中發揮著關鍵的作用。研究結果表明：SRC家族蛋白酪氨酸激酶與主要心臟生理活動和疾病調控過程中的重要信息傳導有關，同時，其功能還與對主要心血管穩態的長期監護作用有關。在各種損傷因素和應激因子的共同作用下，SRC磷酸化水平也發生了改變，從而能夠通過調節其增殖、分化、運動形態和機能以及電生理學變化而達到預防各類慢性心臟病變的作用，包括高血壓、糖尿病、缺血性心臟病、心肌缺血和灌注損害、嚴重心律失常和心肌病等[12]。AKT1 主要參與細胞的增殖、新陳代謝、細胞生長、抗細胞凋亡及血管的生成等諸多細胞過程的調節[13]。TP53 在細胞衰亡的調控中及動脈粥樣硬化的發生發展過程中也起著關鍵作用，通過對細胞增生繁殖和衰亡過程的調控，促使內皮細胞和平滑肌細胞在動脈壁內的再分布。另外，當血管內壁受到各種損傷因素的刺激時，TP53 可啟用損傷信號通路，對損傷的內壁細胞進行修復[14]。HSP90AA1是一種應激誘導蛋白，能夠調節蛋白激酶，并維持細胞穩態。研究發現，HSP90AA1能夠減輕心肌細胞的缺血再灌注損傷[15]，同時能夠與心臟成纖維細胞中轉化生長因子β（TGF-β）結合，抑制心肌細胞的纖維化[16]。STAT3、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3均在炎癥反應中發揮著重要作用。MAPK3 是MAPK 信號通路的重要成員，參與內皮細胞的活性和炎癥[17]。STAT3激活可以促進血管生成、保護內皮細胞、抑制心肌細胞凋亡，改善心肌梗死后心肌重塑[18]。VEGFA 是一種具有促進內皮細胞增殖作用的細胞因子，其與VEGF受體在胞外結合，可促進內皮細胞增殖，增加血管通透性，是血管生成的關鍵介質，誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡并誘導血管通透[19]。

KEGG 通路富集分析發現，6 條主要通路與通陽寬胸方治療SAP相關，包括：PI3K-AKT信號通路、cAMP信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、細胞凋亡、細胞衰老、流體剪切應力。PI3K-AKT信號通路在細胞增殖調控中扮演著至關重要的角色，PI3K-AKT可以減少糖原的合成并增加糖酵解，通過N-磷酸化抑制糖原合酶激酶3β活性增加細胞周期蛋白D1 的積累，從而通過PI3K-AKT 信號通路促進細胞周期并改善細胞增殖，促進細胞生長并抑制凋亡[20]。PI3K-AKT 信號通路還通過多種途徑影響心臟組織中各種細胞因子的產生及表達，調節血管內皮細胞因子的表達，減少血管內皮損傷，從而影響動脈粥樣硬化的發生和發展。此外，PI3K-AKT信號通路可以調節巨噬細胞的極化和存活以及炎癥因子的表達和血小板功能，影響動脈粥樣硬化的進展[21]。cAMP 是一種重要的生物分子，不僅可以激活心肌細胞，還能有效提高已經被激活的心肌細胞的抗損傷能力，進一步增強其對于損傷和缺血缺氧等的抵御能力[22]。動脈粥樣硬化與動脈血管內膜的脂質沉積及血管炎性反應機制關系密切，而動脈粥樣硬化和斑塊形成均可導致動脈管徑狹窄甚至閉塞，是SAP 的重要病理基礎[23]。流體剪切應力指血流對血管壁產生的摩擦力，低流體剪切應力誘導內皮細胞在血流方向的排列失敗，加速炎癥細胞浸潤，促進活性氧的釋放及動脈粥樣硬化斑塊的擴大[24]。血管內皮細胞是血管壁的屏障，在各種病理因素（炎癥因子、氧化應激、放/化療、血流剪切力等）刺激下，血管內皮細胞衰老，內皮損傷和功能障礙，是導致各種急性血管事件的重要病因[25]。細胞凋亡是細胞的死亡形式之一，血管內皮細胞凋亡導致內皮細胞的完整性破壞，脂質沉積，是動脈粥樣硬化發生發展的關鍵因素[26]。袁丁等[27-28]以通陽化濁法干預冠狀動脈粥樣硬化大鼠，結果顯示，通陽化濁法可降低大鼠TC、TG、LDL-C水平以改善血脂狀況，降低IL-17A、VCAM-1 和ICAM-1 的表達以減輕炎癥，減少MMP2、MMP9 表達以增加斑塊穩定性，從縮小斑塊面積與增加斑塊穩定性的角度，基于調脂、抑炎、穩斑，進一步闡釋了通陽寬胸方治療SAP的作用機理。

綜上所述，通陽寬胸方可能通過SRC、TP53、HSP90AA1、STAT3、MAPK3、AKT1、VEGFA 等靶點，調節PI3K-AKT 信號通道、cAMP 信息通道、細胞凋亡、細胞衰老、流體中的剪切應力調節和動脈粥樣硬化等信號通路，起到防治SAP 的效果。通過網絡藥理學分析，可以從整體觀探討中藥多成分、多靶點的藥理作用，對中醫藥機理分析提出了全新的科研思想與方法。本研究成果反映了中藥復方多組分、多靶點、多途徑的藥效特性，為通陽寬胸方治療SAP 提出新思路，但目前網絡藥理學仍然具有不足之處，本實驗結論除了現有資料基礎之外，部分結論還需借助有關實驗進行研究驗證。