EBP50、p16、LMW-PTP 及Ki-67 在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達及臨床意義

谷秀娟，茍江倩，鄭以秀

深圳厚德醫院婦科，廣東深圳 518110

宮頸癌是一種較常見的惡性腫瘤，病死率在各種婦科惡性腫瘤中居于第2 位，僅次于乳腺癌，據相關數據統計得知，在全球當中，每年新增宮頸癌人數為50 萬例，其中，我國患病占比達1/4[1]。宮頸鱗狀上皮內病變（cervical squamous intraepithelial lesion, CIN）實際就是宮頸癌癌前病變，當前，臨床其劃分成3 個等級，即CINⅠ（有著較低癌變可能性并且屬于自限性病變）與有著較高危險性且可能轉變為癌的CINⅡ、Ⅲ[2]。其中CINⅠ屬于低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL），CINⅡ、Ⅲ屬于高級別鱗狀上皮內病變（highgrade squamous intraepithelial lesion, HSIL）。需指出的是，做到對CIN 的及時且準確診治，對于降低宮頸癌發病、病死率十分關鍵，尤其是CINⅡ、Ⅲ病變者。有報道強調，在宮頸病變進展當中，磷酸化蛋白50（ERM-binding phosphoprotein, EBP50）、Ki-67、p16、低分子量酪氨酸磷酸酶（low molecular weight protein tyrosine phosphatases, LMW-PTP）均為可靠標志物，與增殖細胞之間存在緊密聯系，且增殖指數的高低密切相關于腫瘤的分化程度、浸潤、轉移、預后等[3]。為證實此類指標在CIN 中的表達情況及臨床意義，選取2020 年1 月—2023 年6 月深圳厚德醫院收治的62 例宮頸鱗狀上皮內病變（squamous intraepithelial lesion, SIL）患者及同時期62 例宮頸健康者為研究對象，采集其宮頸組織，檢測其中EBP50、Ki-67 等的表達情況并分析其價值?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的62 例宮頸SIL 患者及同期62例宮頸健康的健康體檢者為研究對象。宮頸SIL 患者年齡25～35 歲，平均（29.62±2.79）歲；體質指數19～32 kg/m2，平均（25.94±1.32）kg/m2；經宮頸活檢或手術切除獲取宮頸組織，共62 份，其中LSIL 18 份，HSIL 44 份。健康體檢者年齡25～35 歲，平均（29.60±2.75）歲；體質指數20～31 kg/m2，平均（25.91±1.35）kg/m2；采集其正常宮頸組織，共62 份。兩組研究對象一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。患者及其家屬均知情同意，本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方法

兩組標本都采用中性福爾馬林（10%）進行固定，且實施組織脫水及石蠟包埋。

①試劑。選用產自Abcam 公司的兔抗人EBP50 單克隆抗體，及購自美國Santa Cuze 公司的LMW-PTP 單克隆抗體；采用購自福州邁新公司的小鼠抗人 p16、Ki-67 單克隆抗體及免疫顯色試劑。②免疫組化檢測EBP50、LMW-PTP、p16 與Ki-67 表達。石蠟切片脫蠟至水，采用H2O2甲醇溶液（3%）將內源性過氧化物酶阻斷，以微波熱處理方法對抗原進行修復，后分別將Ki-67（1 ∶ 100）、p16（1 ∶100）、EBP50（1 ∶ 200）、LMW-PTP（1 ∶ 200）抗體加入，待孵育過夜后（4℃），將免疫顯色試劑加入，在特定溫度下（37℃）再孵育30 min。滴加二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色液，并且用蘇木精進行復染，然后對切片進行脫水、封固處理。鱗酸鹽緩沖液代替一抗，作為陰性對照。

1.3 觀察指標

①EBP50。EBP50 蛋白表達于細胞質、細胞核。參照臨床病理特征的相似性，把EBP50 陰性與弱染色明確為低表達，而將中、強染色當作高表達。②p16。p16 陽性染色實際就是鱗狀上皮下1/2，或者是超過下1/2，有連續彌漫性的細胞質與細胞核染色出現；而p16 局灶斑點狀上皮染色或者完全不染色，即陰性表達。③Ki-67。Ki-67 的核染色多出現副基底層，而且陽性細胞數＜30%，即陰性表達；若超出副基底層以上且有細胞核染色出現，同時陽性細胞數≥30%，即陽性表達。④LMW-PTP[4]。參照細胞陽性著色程度（抗原含量）：0 分為陰性，1 分為弱陽性，2 分為中等陽性，3 分為強陽性；根據陽性細胞數量：無陽性細胞為0 分，陽性細胞數為0～＜10%為1 分，10%～＜50%之間為2 分，50%～80%為3分，＞80%為4 分；以積分綜合計量，總積分=著色強度×著色細胞數，陰性表達：0 分，低表達：1～4 分，高表達：＞4 分。

1.4 統計方法

使用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。計數資料用例數（n）和率（%）表示，組間及組內比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIL 患者宮頸組織與正常宮頸組織中EBP50、LMW-PTP、p16、Ki-67 表達對比

SIL 患者宮頸組織中EBP50、LMW-PTP 表達低于正常宮頸組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；SIL患者宮頸組織中Ki-67、p16 的表達高于正常宮頸組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 HSIL 與LSIL 患者宮頸組織中EBP50、LMWPTP、p16、Ki-67 表達對比

HSIL 患者宮頸組織中EBP50、LMW-PTP 的高表達率低于LSIL 患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。HSIL 患者宮頸組織中p16、Ki-67 表達陽性率高于LSIL 患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

SIL 實為一種與子宮頸浸潤癌緊密相關的一組子宮頸病變，以25～35 歲婦女最為多發。大多數LSIL 可自然消退，但HSIL 具有癌變潛能。需指出的是，通過對宮頸SIL 實施病理診斷，對于阻滯宮頸SIL 轉變或進展為浸潤性宮頸癌十分關鍵。近年來，有報道指出，在腫瘤發生、進展中，EBP50、LMW-PTP 起到關鍵性作用。在諸如食道癌、大腸癌、膽管癌等腫瘤中，EBP50、LMW-PTP 的表達顯著減少，而且還密切相關于腫瘤的T 分期、分化程度與淋巴結轉移[5]；但需指出的是，有關其在宮頸SIL 當中的表達情況，少有報道。雖然在宮頸癌變當中p16 聯合Ki-67 進行檢測對HSIL 檢測率的提高有利，但EBP50、LMW-PTP 與p16、Ki-67之間的相關性報道并不多。本文以免疫組化方式就EBP50、LMW-PTP 與p16、Ki-67 在宮頸SIL 患者宮頸組織與正常宮頸組織中的表達情況進行對比，且剖析其在宮頸SIL 患者宮頸組織當中表達的相關性，從中明確此類指標的表達情況及臨床診斷意義。

近年來，宮頸癌患者人數呈現逐年快速增多趨勢。LSIL 能夠自行消退，但HSIL 容易進展為浸潤性癌。有研究發現，在患者臨床治療中，SIL 分級的病理診斷尤為重要[6]。故在宮頸病變臨床診治中，找尋一些生物標志物來對SIL 實施輔助診斷，十分必要。針對EBP50 而言，其實為一種由兩個處于串聯狀態的PDZ 結構域構成，積極參與到蛋白質間的相互作用當中。本研究發現，在正常宮頸組織當中，EBP50、LMW-PTP 均有較高的表達率，而在宮頸SIL 患者宮頸組織當中，則表達率明顯下降（P＜0.05）；另外，其在LSIL 當中的高表達較HSIL 高（P＜0.05）。表明在宮頸SIL 患者宮頸組織當中，EBP50、LMW-PTP 可能喪失保護宮頸鱗狀上皮的作用。p16 為一種典型的細胞周期調節蛋白，不僅能抑制細胞生長，而且還能抑制腫瘤的生物學活性。有學者指出，在正常的宮頸鱗狀上皮當中，p16偶爾有局灶陽性或者完全缺失[7]。HPV E7 蛋白會對視網膜母細胞瘤蛋白進行抑制，造成子宮頸細胞大量增殖及p16 蛋白的不斷積聚，故p16 有助于宮頸疾病診斷準確性的提高。有研究發現，HPV E6/E7m RNA 高表達實為子宮頸癌變的一個關鍵標志[8]。HPV16 病毒所分泌的癌蛋白E6，能夠以一種PDZ 依賴方式與EBP50 相結合，加速EBP50 的降解。E7 能夠借助CDK1/2 對EBP50 進行誘導，使其不斷磷酸化，因而會加速E6 結合及對EBP50 進行降解。LMW-PTP 能夠加速腫瘤的發生與轉移，并且與膜細胞骨架結合蛋白埃茲蛋白之間能夠相互作用，從而參與腫瘤的形成、轉移當中。有研究發現，LMW-PTP 等溶酶體酶在乳腺癌當中能夠以胞吐作用的方式對細胞進行破壞，引發腫瘤，且升高LMW-PTP 的活性[9]。本研究得知，在宮頸SIL 患者宮頸組織中，p16 的陽性率自LSIL 到HSIL 有明顯上升（P＜0.05），表明p16 對SIL 的分級識別有利。多數LSIL 患者的EBP50、LMW-PTP 呈高表達，p16呈現為陰性表達；而在HSIL 患者當中，多數p16（93.55%）為陽性，而EBP50（22.58%）、LMW-PTP（19.35%）呈低表達。與高娜等[10]研究中HSIL 患者宮頸組織中多數p16（91.19%）為陽性，而EBP50、LMW-PTP 呈低表達的結果具有一致性。對于Ki-67，其實為一種細胞增殖指標，同時還是一種在增殖細胞當中表達的核抗原。需指出的是，除了靜止期之外，其在細胞周期的全部階段都有表達。Ki-67 染色能夠對SIL 進展進行預測，在此方面較標準的組織病理學分級優。本研究得知，LSIL 患者宮頸組織中Ki-67 的陽性率較低，而在HSIL 患者宮頸組織中則較高，提示Ki-67 在LSIL 患者宮頸組織中的陽性率較HSIL 低（P＜0.05）。p16、Ki-67 相對應的免疫組化結果實為對HSIL、LSIL 實施病理診斷的關鍵參考指標[11-12]。

綜上所述，EBP50、LMW-PTP 表達在正常宮頸組織當中，多為高表達，而在宮頸SIL 患者宮頸組織當中多為低表達；Ki-67、p16 的表達都伴隨SIL 級別的增加而隨之升高，而EBP50、LMW-PTP 與SIL 級別呈負相關。對此，推測EBP50、LMW-PTP 可用于SIL 的早期診斷，可作為其免疫標志物。