結直腸癌細胞在三維與二維培養環境下增殖機制研究

胡艷艷, 秦寶麗, 周 璐, 邱 月, 椰慧楠, 張欣慰

中國醫科大學腫瘤醫院·遼寧省腫瘤醫院 1.消化內科一病區;2.胸部·食管放療病區;3.中西醫結合科,遼寧 沈陽 110042

結直腸癌是在內、外因素作用下發生的一種多基因表達失調的常見惡性腫瘤,其發病率和病死率在全球范圍內居高不下,嚴重影響人們的身體健康和社會發展[1]。隨著結直腸癌治療靶點和藥物種類逐步增加,對于其治療藥物快速篩選主要通過體外細胞培養,但在二維(two-dimensio,2D)培養環境下與三維(three-dimensio,3D)體內環境存在很大差異。2D培養條件下腫瘤細胞常呈單層貼壁生長,細胞與細胞或細胞外基質接觸較少,與體內腫瘤真實的生長微環境存在差異,不能準確反映腫瘤在體內的真實生長情況[2]。3D培養技術被廣泛應用于生物學和醫學研究領域,尤其對于研究腫瘤微環境、腫瘤細胞生物學行為及抗腫瘤藥物篩選等方面具有重要意義[3]。殼聚糖-膠原水凝膠是一種新型的3D細胞培養材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,在組織工程、藥物篩選和細胞研究等領域廣泛應用[4]。OTU結構域泛素結合蛋白2(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 2,OTUB2)與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)均為結直腸癌細胞增殖及轉移的關鍵因子,調控其表達可能為3D和2D培養差異關鍵靶點[5]。本研究旨在探討結直腸癌細胞在3D與2D培養環境下增殖能力的變化及機制,為體外3D細胞培養材料改進提供理論基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SW480結直腸癌細胞購自上海細胞庫。將SW480結直腸癌細胞分別進行殼聚糖-膠原水凝膠3D培養與細胞培養皿2D培養。2D培養中結直腸癌細胞系SW480培養于10%胎牛血清的DMEM培養基的細胞培養瓶,于37℃、5%CO2的增濕空氣中培養。3D培養中首先制備殼聚糖-膠原水凝膠支架,將殼聚糖原液與膠原按質量比10∶1混合后,連續攪拌1 h,細胞培養基浸泡處理后形成水凝膠。在1 ml水凝膠中加入1×106個結直腸癌細胞于細胞培養箱中培養。

1.2 研究方法 普通光學顯微鏡下觀察2D、3D培養條件下結直腸癌細胞形態。采用細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒測定細胞增殖。在96孔板中加入100 μl細胞懸液,進行相應處理后每孔加入10 μl CCK-8溶液,將培養板在培養箱內孵育2 h。采用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。將制備編碼慢病毒顆粒的重組慢病毒質粒和輔助包裝元件共轉染SW480細胞,過表達OTUB2基因。提取蛋白后,將蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移至聚偏氟乙烯膜上,于含3%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中室溫封閉1 h,采用OTUB2與PCNA抗體以4℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液漂洗3次。二抗室溫孵育1 h,磷酸鹽緩沖液漂洗3次,應用Western印跡試劑盒進行化學發光檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行處理。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3D與2D培養環境細胞形態比較 SW480結腸癌細胞在2D環境培養24 h后可圓形或卵圓形細胞貼壁,7 d后已貼壁的細胞慢慢伸展,呈短桿狀。SW480結腸癌細胞在殼聚糖-膠原水凝膠3D培養24 h后呈3D球狀生長,培養7 d后可見細胞數量增多,細胞球變大。見圖1。

圖1 不同培養條件下細胞形態觀察(a.2D培養24 h細胞;b.2D培養7 d細胞;c.3D培養24 h細胞;d.3D培養7 d細胞)

2.2 3D與2D培養環境細胞增殖速率比較 3D培養環境SW480細胞增殖速率低于2D培養環境,差異有統計學意義(P<0.05)。SW480在3D培養環境培養后1、3、5、7 d的細胞增殖速率均低于2D培養。見圖2。

圖2 3D與2D培養環境細胞增殖率比較

2.3 3D與2D培養環境蛋白表達比較 Western blot法檢測結果顯示,與2D培養比較,3D培養環境培養后結直腸癌細胞系中OTUB2、PCNA蛋白表達均低于2D培養環境,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3D與2D培養環境蛋白表達比較

2.4 3D與2D培養環境細胞轉染比較 轉染后SW480細胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表達、細胞增殖速率均高于轉染前,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 細胞轉染前后基因、蛋白與增殖率檢測比較(a.Western blot結果;b～c.轉染前后細胞蛋白檢測;d～e.轉染前后細胞基因檢測;f.轉染前后細胞增殖率檢測)

3 討論

癌癥預后差與腸癌細胞某些基因的表達水平相關,經過早期篩查和治療的腸癌患者預后更佳[6-8]。體外培養細胞篩查藥物方法主要包括依賴傳統的塑料培養板、異種培養基的2D培養方法與新興的3D培養方法[9]。2D培養作為標準技術能夠使細胞感受和應對微環境信息,方便且高效擴增。但采用2D培養擴增方法培養細胞與體內微環境相差甚遠[10-11]。3D培養是指利用各種方法和材料,使細胞更接近于體內生長狀況。與傳統2D單層培養比較,3D培養為腫瘤細胞在體外的生長提供類似于體內生長環境的生物支撐或基質。此外,在3D培養條件下,細胞與細胞外基質間充分接觸并建立相互聯系[12-14]。水凝膠能夠模擬細胞的體內微環境,為其生長提供基質,更有利于開展結直腸癌細胞系3D培養和生物學調控機制研究。通過殼聚糖與膠原共混制備成水凝膠支架材料,殼聚糖的引入適當增加體系中的正電荷利于細胞有效粘附,而膠原是細胞外基質成分利于細胞功能表達[15-18]。

本研究結果顯示,SW480在細胞培養皿2D培養24 h后貼壁伸展,在殼聚糖-膠原水凝膠中3D培養24 h后呈3D球狀生長。這提示,在殼聚糖-膠原水凝膠支架中SW480細胞能夠進行類似于人體環境的生長,可進一步研究其增殖特點。本研究結果顯示,3D培養環境SW480細胞增殖速率低于2D培養環境,差異有統計學意義(P<0.05)。這提示,3D與2D培養環境下腫瘤細胞增殖速度存在差異,進一步探索其差異機制能夠為3D細胞培養優化和調控腫瘤細胞體內生長特點提供參考。OTUB2能夠通過去泛素化酶的作用調控PCNA促進腫瘤細胞生長[19-20]。本研究中Western blot法檢測結果顯示,與2D培養比較,3D培養環境培養后結直腸癌細胞系中OTUB2、PCNA蛋白表達均低于2D培養環境,差異均有統計學意義(P<0.05)。這提示,3D與2D細胞增殖速率差異與OTUB2、PCNA蛋白表達有關。此外,轉染后SW480細胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表達、細胞增殖速率均高于轉染前,差異均有統計學意義(P<0.05)。這提示,3D環境能夠影響OTUB2基因,進而調控其蛋白表達水平,影響腫瘤細胞生長速度。

綜上所述,殼聚糖-膠原水凝膠3D培養條件下結直腸癌細胞增殖速率減慢,其機制與調控OTUB2、PCNA表達有關。