冷凍精子復蘇后授精方式的選擇對供精IVF/ICSI助孕妊娠結局的影響

漆雨昕，李丹，胡瑞，楊媛，2*

(1.蘭州大學第一臨床醫學院,蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫院生殖醫學中心,蘭州 730000)

男方因素引起的不育癥約占不孕因素的30%～50%[1]。當男性患有非梗阻性無精子癥、重度少、弱、畸形精子癥及相關基因遺傳疾病,使用自身精子可能無法實現臨床妊娠或可導致后代罹患遺傳性疾病時,可以借助供體精子行體外受精(IVF)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)進行助孕治療。臨床上,供精者往往經過嚴格篩選,其精子參數遠遠高于世界衛生組織(WHO)關于男性生育能力最低精子參數的標準[2]。因此,理論上供體精子應該獲得令人滿意的妊娠結局,然而臨床實踐中并非如此。

精子冷凍復蘇后會出現更高的脫氧核糖核酸(DNA)斷裂率[3]、膜脂質組成和頂體狀態的變化以及精子活力的降低[4],繼而降低了受精率,且胚胎發育停滯、自然流產風險增加[5],最終導致不良的助孕結局。此外,取卵周期獲得的卵母細胞質量及數量也是影響授精方式的重要因素。一般情況下,供精夫婦往往選常規IVF-ET受精,但實際操作中發現,解凍后的精液并非全部可行IVF,而且即使精液質量達到IVF標準,若卵母細胞質量異常或患者既往IVF/ICSI周期胚胎質量不好,預測行IVF助孕會導致受精率低下時,臨床醫生會建議患者選擇ICSI或早期補救ICSI(R-ICSI)助孕。據文獻報道,IVF周期中受精失敗的發生率約為3.5%～20%[6]。ICSI可以繞過卵母細胞對精子的自然篩選過程,從而克服了受精障礙,但在一定程度上會損傷卵母細胞。R-ICSI則可避免受精率低或完全受精失敗,但有卵母細胞核質成熟不同步的風險。而授精方式不僅影響受精率還可能影響胚胎發育及妊娠結局。本文旨在通過分析冷凍復蘇后精液的不同授精方式對胚胎發育及妊娠結局的影響,以期為供精助孕時授精方式的選擇提供臨床依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2022年7月在蘭州大學第一醫院生殖中心接受供精助孕治療的237例患者(共243個取卵周期)的臨床資料。

女方納入標準：(1)因輸卵管功能障礙行輔助生殖助孕;(2)體質量指數(BMI)為18～25 kg/m2;(3)無染色體異常。男方納入標準：因梗阻性無精子癥或男方染色體異常或有遺傳性疾病而選擇供精者。

排除標準：(1)女方本周期未獲得卵母細胞者;(2)女方存在內分泌障礙性疾病(糖尿病、甲狀腺功能異常等);(3)因女方卵巢早衰、染色體異常等原因接受供卵者;(4)女方存在影響受精及胚胎植入的基礎疾病(如未經治療的輸卵管積水、Ⅲ期或Ⅳ期子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、其他導致子宮內膜病變的疾病、生殖道畸形及女方結核病史等)。

根據精液冷凍復蘇后采用授精方式的不同分為3組：IVF組(108個取卵周期)行常規IVF授精;ICSI組(67個取卵周期)行ICSI授精;早期補救ICSI組(R-ICSI組,68個取卵周期)行R-ICSI授精。

本研究經我院倫理委員會審核批準,且進入治療前所有患者均簽署了知情同意書。

二、研究方法

1.控制性卵巢刺激：女方采用早卵泡期長方案或拮抗劑方案進行卵巢刺激,陰道超聲下探及2～3個主導卵泡直徑≥18 mm時,停止促排,當晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠)4 000～10 000 U進行扳機,33～36 h后在B超引導下經陰道穿刺取卵。若患者出現卵巢過度刺激綜合征等不適宜胚胎移植的情況時行全胚冷凍。

2.胚胎移植及黃體支持：(1)新鮮胚胎移植：取卵后第3日移植1～2枚卵裂期胚胎或第5日移植1～2枚囊胚。(2)凍融胚胎移植(FET)：平素月經規律、無排卵障礙的患者采用自然周期準備內膜,平素月經不規律、存在排卵障礙的患者采用人工周期準備內膜,當內膜厚度≥7.0 mm、雌二醇(E2)≥732 pmol/L時,同時給予孕激素轉化內膜,于第4日行FET。移植后給予陰道放置黃體酮軟膠囊(安琪坦;Besins-Healthcare,法國)600 mg/d和口服地區孕酮片(達芙通;蘇威制藥,荷蘭)30 mg/d進行黃體支持。

3.精液處理：供精來源于蘭州大學第一醫院人類精子庫,精液質量符合精子庫相關標準和技術規范,供受者血型相符。女方取卵后解凍供精冷凍精液標本。將精子凍存管投入37℃水浴10 min,精液復蘇后精子活動率>40%,采用密度梯度離心法獲得活動精子。

4.授精方式：(1)IVF：HCG注射后38～40 h,精卵共培養6 h后,去除卵丘顆粒細胞,置于培養液微滴中觀察第二極體的排出情況。(2)ICSI：取卵后3～4 h去除卵丘顆粒細胞,對MⅡ卵母細胞進行ICSI,ICSI具體操作過程同R-ICSI。(3)R-ICSI：對于IVF受精6 h后第二極體排出率低于30%,或成熟卵母細胞均未排出第二極體者行R-ICSI。選擇形態正常的精子顯微注射到MⅡ卵母細胞質中。

5.妊娠結局判定標準：胚胎移植后4周進行陰道超聲檢查,宮腔內可見妊娠囊者定義為臨床妊娠。新鮮胚胎移植或FET后臨床妊娠視為本取卵周期妊娠,1次取卵后所獲的可移植胚胎全部移植完均未妊娠視為本取卵周期未妊娠。胚胎于宮腔外著床定義為異位妊娠。妊娠14周之前胚胎停止發育或已經發生胚胎死亡并且未自然排出宮腔者定義為胚胎停育。妊娠不足28周或胎兒體質量不足1 000 g而終止妊娠者定義為流產。妊娠28周后分娩活嬰定義為活產。

6.觀察指標：主要觀察指標為累計活產率(CLBR)。CLBR定義為每個取卵周期至少有1次活產的分娩比例,包括所有鮮胚移植和/或FET,直到1次分娩時有活產或直到所有胚胎被使用(二者以先發生的為準),累計活產率=活產周期數/取卵周期數×100%[7]。次要觀察指標包括臨床妊娠率、流產率、胚胎停育率、異位妊娠率。其中,臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%,流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%,胚胎停育率=胚胎停育周期數/臨床妊娠周期數×100%,異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學方法

結 果

一、患者一般情況比較

本研究納入了接受供精助孕治療的237例患者(共243個取卵周期)。根據精液冷凍復蘇后采用授精方式的不同分為IVF組(108個取卵周期)、ICSI組(67個取卵周期)和R-ICSI組(68個取卵周期)。

3組患者間年齡、BMI、基礎竇卵泡數(AFC)、不孕年限、不孕類型、抗苗勒管激素(AMH)、基礎性激素水平比較,均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者一般情況比較[(-±s),%]

二、供體精液冷凍復蘇處理后精液參數比較

ICSI組及R-ICSI組患者精子濃度、活動率、非前向運動精子顯著低于IVF組(P<0.05);ICSI組的前向運動精子顯著低于IVF組及R-ICSI組(P<0.05),而不動精子顯著高于IVF組及R-ICSI組(P<0.05)(表2)。

表2 三組供體精液冷凍復蘇處理后精液參數比較(-±s)

三、患者促排卵及胚胎實驗室指標比較

3組患者的Gn天數、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日孕酮(P)水平、獲卵數、MⅡ卵數、2PN數及受精率比較均無顯著性差異(P>0.05);ICSI組患者的可利用胚胎數及優質胚胎數顯著低于IVF組及R-ICSI組(P<0.05);ICSI組的優質胚胎率略低于其他兩組,但無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

四、患者妊娠結局比較

3組患者進行了鮮胚移植和FET共254個周期。各組間移植胚胎數、移植日子宮內膜厚度及異位妊娠率比較均無顯著性差異(P>0.05)。ICSI組臨床妊娠率及累計活產率略低于IVF組及R-ICSI組,流產率及胚胎停育率略高于其他兩組,但無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 三組患者促排卵及實驗室指標比較[(-±s),%]

表4 三組患者妊娠結局比較[(-±s),%]

討 論

臨床上采用供體精子行助孕治療時,會有多種因素影響授精方式,如復蘇后精液質量,本周期獲得卵母細胞數目及質量等。當供體精液解凍后精液質量在正常參考值范圍之內,常采用IVF方式授精,若IVF受精率低于30%甚至未受精者,即行短時受精加R-ICSI授精。由于某些供精者存在潛在的影響精液質量的危險因素如生活習慣不良、長期吸煙等,以及精液冷凍過程中的損傷[8],部分供體精液標本在復蘇后存在嚴重少、弱、畸形精子癥,可直接采用ICSI助孕。此外,一些卵母細胞質量異常如透明帶明顯異常的卵母細胞自然受精能力下降[9],或者本周期獲卵數少,即使精液復蘇后參數達到IVF授精標準,考慮卵母細胞質量情況,選擇ICSI或R-ICSI方式授精的情況也時有發生。

ICSI與IVF不同,它需要機械去除卵丘細胞,然后通過顯微操作系統將單一精子注射入卵母細胞內使其受精。自1992年以來,ICSI作為克服IVF受精失敗的一種手段已被廣泛應用,國外多數生殖中心在使用供體精子的助孕周期中常規實施ICSI,以避免精子冷凍損傷可能帶來的受精能力低下,但ICSI操作過程對于卵母細胞的損傷不容忽視。Chen等[10]研究報道,對受精后6 h未排出第二極體的卵母細胞進行R-ICSI,獲得了較高的妊娠率,且該研究是R-ICSI的首次報道。R-ICSI技術可以顯著提高受精率,改善成功妊娠的概率,但由于卵母細胞暴露時間過長無法保障核質發育的同步性,進而影響后續胚胎發育。

在本研究中,ICSI組及R-ICSI組患者精子濃度、活動率、非前向運動精子顯著低于IVF組(P<0.05);ICSI組的前向運動精子顯著低于IVF組及R-ICSI組,而不動精子顯著高于IVF組及R-ICSI組(P<0.05),3組供體精液冷凍復蘇處理后精液質量大部分達到正常標準。由于冷凍-解凍過程會降低精子質量,且冷凍前供精者精液質量不同,解凍復蘇后精液質量參差不齊,為保障良好臨床結局,臨床醫生常采用ICSI及R-ICSI提高受精率并獲得可用胚胎。Ozimic等[11]研究證實了冷凍-解凍程序會改變新鮮精子的活力,張宏展等[12]證明了前向運動精子總數降低對受精失敗有一定的預測價值,并建議前向運動精子總數較低的患者行ICSI或R-ICSI助孕以避免受精失敗。

精子的冷凍-解凍程序對染色質結構有損害,導致注射到卵母細胞后精子細胞核去凝的潛在風險,從而降低胚胎發育潛力[13]。有研究證實精液解凍后DNA碎片指數(DFI)顯著高于冷凍前[3],DFI是評估精子DNA完整性的指標,表示精子DNA的受損情況。Li等[14]研究發現高DFI患者行IVF/ICSI助孕時胚胎發育潛力差。這與本研究結果相似：3組患者間受精率無顯著性差異(P>0.05),但ICSI組患者的可利用胚胎數及優質胚胎數顯著低于IVF組及R-ICSI組(P<0.05);ICSI組的優質胚胎率雖與其他兩組無顯著性差異(P>0.05),但有略低于其他兩組的趨勢。其原因可能是被注射入卵母細胞的精子DNA損傷嚴重時,胚胎發育過程中可能會出現細胞分裂異常,導致胚胎碎片的形成增加。Asmarinah等[15]得出了相似的結論,即精子染色質的成熟度低和完整性差可能會影響ICSI后的受精卵發育。此外,ICSI操作過程會增加損傷卵母細胞的機會并改變卵母細胞蛋白質組學[16],進一步影響胚胎發育。Wiener-Megnazi等[17]研究發現在使用供體精子進行助孕治療的患者中,相較于IVF授精,ICSI的使用與較低的優質胚胎率有關。

本研究中,ICSI組在取卵后3～4 h去除卵丘顆粒細胞,R-ICSI組在取卵后6 h去除。有研究認為,卵母細胞中細胞質成熟的時間晚于細胞核成熟的時間[18];Falcone等[19]發現在取卵后5～6 h卵母細胞的細胞核質發育同步,這一時間段進行ICSI可獲得良好的胚胎質量和妊娠率。本研究中,ICSI組的胚胎質量略低于R-ICSI組可能與培養時間過短、注射卵母細胞核質成熟不同步有關。R-ICSI的時間優勢可以預防卵母細胞的不完全成熟,保證了胚胎質量及胚胎正常發育。此外,卵丘細胞可為卵母細胞提供糖胺聚糖、類固醇激素和營養素等因子,這些因子對卵母細胞的核質成熟、受精和發育起著關鍵作用[20]。R-ICSI操作中,卵丘細胞與卵母細胞接觸時間較長,卵母細胞成熟度較高,具有更好的發育潛能,更有利于成功受精和胚胎發育。

本研究結果表明,R-ICSI組患者精液質量低于IVF組,但與短時受精相比,R-ICSI患者的胚胎發育及妊娠結局均無顯著差異(P>0.05)。這與Huang等[21]的結論相似。賀慧等[22]研究認為,與IVF組相比,R-ICSI并未影響試管嬰兒助孕結局,其可作為短時受精失敗的預防措施。蔣彥等[23]的研究得出了相似結論：使用供體精液的夫婦IVF受精失敗后,R-ICSI的方法可使患者獲得較好的妊娠結局。

ICSI組的臨床妊娠率及累積活產率略低于IVF組及R-ICSI組,流產率及胚胎停育率略高于其他兩組,但可能由于納入樣本量較少,尚未表現出顯著性差異(P>0.05)。之前吳麗敏等[24]的研究中,ICSI組與R-ICSI組的妊娠結局亦無統計學差異,但ICSI組的累計活產率略高于R-ICSI組。這可能是因為納入的患者人群不同,吳麗敏等[24]的研究關注的是使用夫精的不孕患者,并無冷凍保存對精液造成損傷;而我們的研究集中于供體的冷凍精液。本研究結果證明使用ICSI助孕并不能提高冷凍損傷精液的臨床妊娠結局。

本研究也存在一些不足：首先,僅納入了單個生殖中心的數據,樣本量較小;其次,未隨訪子代的健康情況;最后,本研究為回顧性研究,研究結論可能存在一定的局限性,后續應開展更大樣本量的前瞻性研究加以探討驗證。

綜上所述,輔助生殖技術的成功取決于精子和卵母細胞的質量,供體精液冷凍復蘇后必須得到適當處理以獲得高質量的精子,但冷凍損傷不可避免,進而影響受精、胚胎發育及妊娠結局;其次,卵母細胞的質量及數量也無法精確把控,因此授精方式的選擇至關重要。臨床工作中即使復蘇后精液質量達到行IVF授精的標準,但因卵母細胞質量及臨床醫生經驗不同選擇ICSI或R-ICSI授精的情況不在少數。本研究結果提示冷凍精子復蘇后行IVF及R-ICSI助孕的胚胎質量及累計活產率有優于ICSI的趨勢,因此建議行供精助孕治療時優先選擇IVF授精,當存在卵母細胞因素或其他因素預測IVF受精率低下時可行R-ICSI以獲得較好的妊娠結局。