卵巢儲備功能減退相關基因及組學研究進展

周立飛，鄭琳璐，李林青，王文藝，李建磊，，張萍萍，孫艷美，李亞麗*

(1.河北省人民醫院生殖遺傳科,石家莊 050000;2.華北理工大學研究生學院,唐山 063210;3.河北北方學院研究生學院,張家口 075000;4.河北醫科大學研究生學院,石家莊 050000)

卵巢儲備功能減退(DOR)作為女性最常見的不孕癥之一,通常是由于卵巢儲備功能下降導致的治療周期取消率高和受精率低[1]。據統計,DOR在年輕女性中的發病率為10%,并且在不孕婦女中所占比例逐年增加,是造成女性不孕癥的重要原因之一,但DOR的發病機制至今尚未明確,可能與年齡、遺傳因素、自身免疫因素、醫源性(手術、放療、化療)等有關[2]。DOR主要以卵泡發育成優質卵母細胞的潛能下降為特征,臨床主要表現為不孕、月經不調、圍絕經期綜合征和受精能力減弱等,因其卵巢對外源促性腺激素的反應力低和妊娠丟失率高的特點是女性生殖內分泌領域的一大挑戰。目前對DOR的診斷標準為：周期第2～5天卵泡刺激素(FSH)>10 U/L,抗苗勒管激素(AMH)水平<0.5～1.1 ng/ml,或小于5個2～10 mm的早期竇狀卵泡[3]。近年來隨著技術的發展,基因組學、代謝組學和蛋白質組學對DOR的發病機制研究中取得了一定的進展,疾病的發生與發展是動態變化的。現就近年來有關DOR病因學的研究進行綜述,以期為早期診斷、干預和治療DOR患者提供新思路。

一、與DOR發生相關的基因

1.FMR1基因：FMR1基因位于性染色體Xq27.3上,其5′端UTR區(CGG)n的重復數在前突變(50～200)的個體患DOR的風險增加,主要是未被翻譯的mRNA與其相關蛋白形成包涵體的蓄積會影響女性的卵巢功能。一項研究發現,在性腺中高度表達的多功能RNA結合蛋白Sam68在顆粒細胞中被隔離,很可能是通過與擴增的CGG重復轉錄物的相互作用導致可用于卵泡刺激素受體(FSHR)前體轉錄物加工的游離Sam68減少,引起FSHR轉錄物成熟的失調,從而導致卵巢對FSH刺激反應性降低[2,4-5]。FMR1的基因突變與卵巢功能障礙相關,一般通常為月經規律、卵巢儲備功能下降、卵泡數量減少、生育力減退[4]。FMR1重復序列的分布因種族而有差異,西方國家DOR患者中攜帶FMR1前突變的患者較多,然而在亞洲國家攜帶者較少。在一項關于DOR女性的AMH水平與FMR1基因CGG重復數的研究中,證實在DOR的患者中,似乎FMR1基因CGG重復數≥35次女性的AMH隨年齡的增長比CGG重復數<35次者下降得更快[2,4]。這種基因檢測方法可能未來會被應用于識別DOR患者,為未來預防和治療DOR提供新思路。

2.HFM1基因：HFM1基因是卵巢早衰(POF)的候選基因,也被稱為POF9,位于染色體1q22,由39個外顯子組成,編碼在生殖系細胞中特異表達的減數分裂解旋酶1(HFM1),最早在卵巢早衰(POF)患者中報道。有研究者在一個有DOR且體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結局差的家系中發現了HFM1基因的兩種新的復合雜合子剪接變異[6]。在一項特異性敲除小鼠卵母細胞中HFM1的研究中,證實了HFM1基因對小鼠卵巢卵泡儲備耗竭和生育力的作用,特別是在被敲除的小鼠卵母細胞中容易觀察到異常紡錘體、染色體排列不齊、皮質肌動蛋白帽丟失、小鼠卵巢卵泡儲備耗竭加速和極體排出失敗的現象,進一步的研究表明,HFM1可能參與MAPK信號通路調控紡錘體遷移和不對稱分裂[7]。更重要的是,一項通過植入前遺傳學檢測評估整倍體率的研究顯示,與卵巢儲備正常(NOR)不孕婦女相比,DOR女性的非整倍體胚胎百分比升高23 %,這也是導致胚胎停滯的原因之一[8]。

3.GREM1基因：GREM1是生長分化因子9(GDF9)的下游基因,由卵巢顆粒細胞(GCs)分泌,是在卵泡發育信號通路中發揮交互作用的重要調節分子,位于染色體15q13-15q15,由2個外顯子及1個內含子組成[9]。最早被確定為骨形態發生蛋白的拮抗劑在惡性腫瘤中報道,通常會因啟動子高甲基化而沉默,參與多種腫瘤的進展,其中在乳腺癌組織中發現GREM1上調,誘導上皮間質轉化[10]。GREM1參與調節與胚胎發育相關的GDF9和骨形態發生蛋白15(BMP15)的平衡,GDF9、BMP15和BMP6目前被認為是負責排卵期間卵丘GCs擴增的卵母細胞調控的最佳候選分子,這對于體內正常卵母細胞發育發揮重要的作用[11]。為了研究GREM1是否參與DOR的發病及多卵巢GCs的影響,研究者在年輕DOR女性的卵丘細胞中發現GREM1基因表達下調[12]。隨后研究者證實了GREM1通過調節GCs擴展過程影響卵泡發育和卵巢儲備功能,GCs擴展相關基因的表達隨著外源性GREM1蛋白濃度的增加而提高,且有濃度依賴性[9,12]。雖然因果關系尚不清楚,但這些觀察結果可能反映了GDF9或其他卵丘生理學卵母細胞分泌介質的潛在缺陷,值得進一步挖掘研究。GREM1基因可能為未來預防和治療DOR提供新的靶點。

因此FMR1、HFM1、GREM1基因與女性生殖和DOR密切相關,但具體相關機制需進一步挖掘。最近,通過全外顯子測序技術在POF家族中確定了一系列新基因包括STAG3、GDF9、MCM8、SGO2和NUP107[13]。有關DOR遺傳因素的研究雖取得了一定的進展,但相關機制仍不清楚,目前仍有一些候選基因有待發現,需開展更為深入的研究和探索。

二、與DOR發生相關的RNA

1.長鏈非編碼RNA(lncRNAs)：是長度超過200個氨基酸但不編碼蛋白質的在人類生理、病理調節過程中起重要作用的功能性RNA分子,其中一些lncRNA被確定在卵泡的形成和發育中起著重要的作用[14]。在一項病例對照研究中,通過收集、檢測DOR與NOR不孕患者GCs中的lncRNA,篩選出與DOR相關的466個差異表達的lncRNA,其中有244個lncRNA表達上調,222個lncRNA表達下調。這些差異表達的lncRNA與細胞黏附、蛋白質消化吸收、胚胎發育和甲狀腺激素信號通路等有關,與DOR疾病的發展密切相關[15]。但這些lncRNA如何調控DOR的機制尚不清楚,還需要進一步反復研究和驗證。

2.微小RNA(miRNA)：miRNA是由22～24個核苷酸組成的一類小的非編碼RNA,在細胞增殖和卵泡發病機制中起著重要的作用,廣泛參與正常和疾病狀態[16]。最近在DOR與NOR患者GCs差異表達的研究發現,DOR婦女GCs中miR-484水平升高,并伴有人類GCs中Yes相關蛋白亞型1(YAP 1)水平降低和人類GCs功能受損以及miR-484在GCs中的表達水平與基礎FSH水平呈正相關;隨后實驗發現,用si-YAP1轉染的GCs呈現出更高的氧化應激損傷以及早期和晚期凋亡細胞百分比增加,這些結果與過表達miR-484的GCs的表型一致;推測YAP 1是miR-484在GCs中的直接靶點,miR-484通過YAP 1介導的線粒體功能和凋亡調節GCs功能,從而降低卵巢儲備功能[17]。呂清媛等[18]在卵巢儲備功能異常(DOR、POF)患者血漿差異表達的研究中發現,miR-15b、miR-22的表達顯著下降,二者可能與DOR的病情發展有著密切的聯系,但在卵巢病理、生理中的機制尚不明確,需要進一步深入分析。Wei等[19]研究中發現DOR的高齡女性miR-221-3p的表達顯著低于NOR的年輕女性,隨后實驗進一步闡明了FOXO1是miR-221-3p的直接靶基因,miR-221-3p的下調可能上調FOXO1表達,通過促進卵巢GCs凋亡而促進DOR的發病機制。此外,miRNA還通過影響GCs在女性生殖系統疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)中發揮重要作用,系統地鑒定GC特異性miRNA將有助于研究者更好地了解卵巢疾病相關的潛在機制,從而為進一步研究GCs和卵泡的功能奠定基礎。

外泌體是直徑約30～150 nm由多種細胞分泌的,在免疫應答、胞間通訊、RNA轉運和細胞間物質交換中發揮巨大作用的膜性囊泡[20]。一項通過研究DOR患者和NOR患者的卵泡液外泌體miRNA的差異表達發現,與NOR組相比,DOR患者卵泡液中存在80個有明顯表達差異的miRNA,其中hsa-miR-4792、hsa-miR-184等31個miRNA表達上調,hsa-miR-136-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-335-5p等49個miRNA表達下調,其對相關靶基因預測發現與脂多糖介導的信號通路和卵泡或卵母細胞發育相關通路有關[21]。因此我們推斷外泌體miRNA通過與靶基因靶向結合在DOR中發揮著重要作用,但其涉及的生物學通路需要進一步深入研究。

三、與DOR發生相關的代謝組學研究

氧化應激是DOR患者生育力下降的主要原因之一。卵泡液是卵母細胞的微環境,在卵母細胞的成熟及胚胎發育過程中起著重要的作用。

有研究者比較了DOR患者與正常婦女卵泡液中脂質代謝產物的差異表達情況,結果發現這些差異代謝物主要富集在膽堿代謝、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染和葉酸生物合成中[22];另有研究發現DOR組脂肪酸、2-羥色酮、孕酮-3-葡萄糖醛酸苷的表達顯著降低,2-羥雌酮是雌激素及其衍生物的有機化合物,存在于所有脊椎動物中,具有刺激細胞生長,并阻斷可能致癌的更強雌激素的作用[23-25];還有研究比較了DOR與NOR卵泡液中的氧化脂質差異,結果發現DOR患者卵泡液中有15種氧脂素代謝產物含量低于NOR組,這些差異氧化脂質代謝產物中有9種與獲卵數和受精率有關,有8種與FSH水平呈負相關,有1種與優質胚胎數呈正相關,但均與花生四烯酸代謝途徑密切相關[24],研究者由此認為在這些氧脂素代謝物中,花生四烯酸代謝發生了可能與卵母細胞發育有關的顯著變化,導致DOR患者生育能力下降。何瑞芬等[26]采用非靶向代謝組學分析技術對18例DOR患者和18例NOR患者的卵巢GCs進行了代謝組學研究,鑒定出的差異代謝物與炎癥反應和類固醇物質有關,可影響類固醇合成通路,進而引起類固醇物質合成豐度下降,從代謝水平闡明了類固醇激素對疾病的相關性。

脂質代謝物的發現為DOR的發病機制提供了新的線索,為反復移植失敗患者卵泡液中的代謝變化提供了新的檢測途徑和治療靶點。

四、與DOR發生相關的蛋白質組學研究

1.血液蛋白質組學：一項確定非肥胖DOR患者血清視黃醇結合蛋白4(RBP4)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)濃度與卵巢儲備之間關系的橫向研究中,發現了DOR患者血清RBP4水平降低,血清hs-CRP水平升高,而且血清RBP4水平與AMH水平呈正相關[27],因此得出了氧化應激在DOR中起作用的事實,維生素A參與了DOR患者卵巢儲備的恢復的可能性,為卵巢儲備調節的潛在機制提供了新的見解。

2.卵泡液蛋白質組學：卵泡液中含有生物活性分子影響著卵母細胞質量、受精和胚胎發育。卵泡液蛋白質組學的研究描繪了一種新的分子生化過程,在描述生物標志物的輪廓方面具有重要影響,為分析人類卵泡液提供了一種新思路,可用于卵母細胞質量評估和改善體外受精-胚胎移植技術結局[28]。

在一項卵巢低反應性蛋白質組學分析的研究中,發現了66種差異表達蛋白下調、65種差異蛋白上調,其中3種蛋白質(妊娠區蛋白、腎素和含sushi重復蛋白SRPX)的差異表達被認為具有統計學意義[29];隨后有研究還發現了卵巢低反應組的血管生長因子表達增加,但卵泡液中血管生長因子的水平與胚胎質量呈負相關[30]。有研究者分析了DOR患者與正常受試者卵泡液中的差異表達蛋白質,發現了31個差異表達蛋白,包括10個上調蛋白、21個下調蛋白,這些差異表達蛋白主要與細胞增殖和細胞信號通路有關;后來研究還發現了DOR患者卵泡液中人前列腺酸性磷酸酶(PAP)水平降低和CD5抗原樣蛋白(CD 5L)水平升高[31]。

這些差異表達蛋白的發現為卵母細胞質量的測量提供了新的思路。但目前關于DOR患者的卵泡液蛋白質研究還遠遠不足,我們期待建立更加完整的卵泡液蛋白質網絡,為發現新靶點進而為靶向治療提供新依據。

3.卵巢GCs蛋白質組學：近期有研究者進行了一項比較行卵胞漿內單精子注射(ICSI)的DOR患者與正常女性卵巢GCs中介導細胞凋亡的蛋白水解酶3(caspase-3)、細胞色素c和熱休克蛋白70(Hsp 70)的表達水平與妊娠結局的前瞻性研究[32],發現在DOR組中,Hsp70表達水平與D3優質胚胎數呈正相關、與雌二醇水平呈負相關,而細胞色素c的表達水平與D3優質胚胎的數量呈負相關;卵丘-卵母細胞復合物中卵丘細胞擴展較差患者與凋亡蛋白表達水平升高、抗凋亡蛋白表達水平降低以及有或無DOR婦女的ICSI臨床結局較差相關。

有必要進行更多的組織病理學和遺傳分子學研究,以探討不同的凋亡相關生物標志物在接受ICSI治療的婦女卵巢GCs中的功能作用。

4.T淋巴細胞蛋白質組學：有研究者比較了DOR患者與NOR患者中的T淋巴蛋白的差異表達,結果發現DOR患者卵泡內CD8+T細胞數量增加,CD8+/CD4+T細胞比例升高,趨化因子配體5(CCL 5)和γ干擾素(IFN-γ)水平升高,這些變化可能涉及GCs的凋亡、卵母細胞質量降低和卵泡閉鎖[33]。隨后在GCs與CD8+T細胞體外共培養實驗研究中發現,CD8+T細胞抑制GCs增殖并通過內在的細胞凋亡途徑促進其凋亡,同時凋亡的GCs產生并釋放大量的CCL5,而CCR5與GCs相互作用,將CD8+T淋巴細胞重新吸引至卵泡[33-34]。

有關T淋巴細胞蛋白在DOR發病進程中如何發揮作用還有待進一步研究,為DOR的臨床診斷和治療提供新的生物標志物和潛在的藥物靶點。

綜上所述,目前蛋白質組學在DOR疾病中的應用主要集中在探索發病機制、刪選診斷標記物等方面,差異表達蛋白主要影響了細胞增殖和細胞信號通路,研究所用的樣本主要是血液、卵泡液、GCs、淋巴細胞和組織等。

五、結論與展望

近年來,基因組學、代謝組學和蛋白質組學被越來越多地應用于生殖疾病的病因學研究,取得了豐碩的研究成果。首先,目前DOR發病機制的研究主要集中在生物分子水平上,基因層面的研究少而分散,許多基因參與的具體方式尚不明確;其次,蛋白質組學的應用尚存在較多困難與挑戰,在蛋白質組學技術的選擇上存在著較大差異,這會導致不同研究成果出現的可能。就現有研究而言,缺乏大數據、大樣本的理論證據,但相關證據依然加深了我們對DOR病因學的認識和了解。臨床中多采用調節雌孕激素來增加獲得卵母細胞的數量,已有褪黑激素具有抗DOR活性從而保護卵母細胞質量的報道[35],但具體機制仍需進一步深入研究;雖然沒有直接檢測卵巢儲備的方法,但多采用一些生物標志物,如AMH、FSH和抑制素B(INH B)作為臨床實踐中生殖潛力的預測因子[36]。然而,因個體差異,因DOR原因導致女性不孕的比例依舊很高。鑒于DOR的發生對患者本人和輔助生殖結局的影響,深入進行DOR確切發病機制的研究仍然是輔助生殖領域的熱點和難點。