卵巢儲備功能下降患者常規(guī)體外受精多精受精發(fā)生的影響因素分析

賈瑤，孫亞婷，張露云，王佳，常江璇，朱愛珍

(山西省運城市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,運城 044000)

卵巢儲備功能下降(DOR)是指卵巢功能不足,由于卵巢內(nèi)存留的卵母細(xì)胞數(shù)量減少或(和)質(zhì)量下降,造成女性生育能力下降,同時伴有基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)水平升高、竇卵泡數(shù)(AFC)減少、抗苗勒管激素(AMH)水平降低[1]。DOR在人群中的發(fā)病率約為10%～35%[2]。

在生理狀況下卵母細(xì)胞有一系列的保護措施來保障有且僅有一條精子穿過卵細(xì)胞膜,從而形成精原核并與卵原核融合成二倍體受精卵[3]。但在輔助生殖技術(shù)(ART)中,由于各種因素的影響譬如精液濃度、卵母細(xì)胞質(zhì)量以及受精環(huán)境等,使得多精受精的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然狀態(tài)[4]。這種多精受精卵發(fā)育成胚胎后移植回母體后可導(dǎo)致流產(chǎn)、多倍體畸形兒及葡萄胎的發(fā)生,因此在實驗室中往往選擇廢棄。而DOR患者本身可獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量較少,一旦出現(xiàn)多精受精會導(dǎo)致可移植的胚胎數(shù)降低甚至無胚胎可移植[5]。降低DOR患者常規(guī)體外受精(IVF)過程中多精受精的發(fā)生率至關(guān)重要。因此,本研究選擇DOR患者作為研究對象,探討其常規(guī)IVF多精受精發(fā)生的影響因素,以期更好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生開展個體化促排卵治療,降低多精受精的發(fā)生,提高卵子的利用率,繼而增加可移植胚胎數(shù)目,增加患者受孕機會。

資料與方法

一、研究對象

本研究為回顧性病例對照分析。選擇2020年9月至2023年5月在山西省運城市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受常規(guī)IVF助孕治療的399例DOR患者(共399個周期)為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷為不孕癥;(2)采用高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案IVF助孕治療;(3)符合臨床DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)AFC<5～7個,或AMH<1.1 ng/ml,或連續(xù)兩個月經(jīng)周期的基礎(chǔ)FSH≥10 U/L[2]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)行補救ICSI者;(2)不孕因素為男方因素;(3)夫妻雙方任意一方染色體核型異常;(4)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者等。

分組情況：按照本周期是否發(fā)生多精受精,將399個周期分為兩組,分別是正常受精組(272個周期)和多精受精組(127個周期)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COS)及取卵：采用PPOS方案促排卵,于月經(jīng)周期第2～3日起口服地屈孕酮(達芙通,雅培,荷蘭)20 mg/d,同時使用尿促性素(HMG;珠海麗珠制藥)150～225 U/d并聯(lián)合肌肉注射FSH(麗申寶,珠海麗珠制藥)75 U/d,根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整促性腺激素(Gn)用量,必要時添加促性腺激素釋放激素拮抗劑[GnRH-ant;醋酸西曲瑞克(思則凱),默克雪蘭諾,德國]直到HCG注射日。當(dāng)1個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm,或有2～3個卵泡直徑≥16 mm,或直徑>14 mm的卵泡數(shù)超過2/3,且血雌二醇(E2)水平與成熟卵泡數(shù)符合(每成熟卵泡E2水平915～1 098 pmol/L)時肌肉注射10 000 U尿源HCG(珠海麗珠制藥)或重組人絨促性素(rHCG;艾澤,默克,意大利)250 μg +HCG 2 000 U,進行扳機。HCG注射后36 h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)穿刺取卵,抽吸直徑14 mm以上卵泡,將獲取的卵-冠-丘復(fù)合物放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h。

2.精液處理及短時授精：取卵手術(shù)之前要求患者配偶禁欲2～7 d。取卵當(dāng)日告知患者配偶以手淫法將全部精液留置在取精杯中。待精液液化后,采用密度梯度離心和上游法相結(jié)合的方法來處理精液。密度梯度離心分離液使用Spermient(Cook,澳大利亞),洗滌液和上游液分別為配子緩沖液(Gamete buffer;Cook,澳大利亞)和受精培養(yǎng)液(Fertilization medium;Cook,澳大利亞)。采用四孔板授精,取卵前每孔加入0.6 ml受精培養(yǎng)液,蓋油放置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中過夜平衡。授精時取上游的最上層精子,通過精子計數(shù)每孔加入1.0×105條精子并在每孔放置2～3枚卵-冠-丘復(fù)合物,將四孔板放置在培養(yǎng)箱(37℃、6%CO2、5%O2、飽和濕度)中孵育4～5 h。

3.脫顆粒及受精觀察：常規(guī)IVF授精4～5 h后使用140 μm的剝卵針(Cook,澳大利亞)剝除卵子周圍的卵丘顆粒細(xì)胞,然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至過夜平衡好的卵裂培養(yǎng)液(Cleavage medium;Cook,澳大利亞)中觀察第二極體是否排出。若有1/2的成熟卵子均可見明顯的2個極體,則將卵母細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),18 h后再次觀察受精情況,觀察到2個原核(2PN)的受精卵判定為正常受精,3個及以上原核(≥3PN)的受精卵判定為多精受精。

三、觀察指標(biāo)

本研究的主要觀察指標(biāo)有：(1)基礎(chǔ)資料,包括女方年齡、不孕年限、不孕類型、不孕因素、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AFC、基礎(chǔ)FSH和基礎(chǔ)AMH水平;其中BMI的評價參考世界衛(wèi)生組織(WHO)及之前文獻的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6-7],分為正常體重(18.5 kg/m2≤BMI≤24.9 kg/m2)、超重(25.0 kg/m2≤BMI≤29.9 kg/m2)和肥胖(BMI≥30.0 kg/m2);(2)COS相關(guān)指標(biāo),包括Gn啟動劑量、Gn總量、Gn天數(shù)、直徑≥14 mm卵泡數(shù),以及扳機日E2、LH、孕酮水平及獲卵數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、納入患者的整體情況及基本資料比較

本研究共納入399個周期,其中272個周期無多精受精情況的發(fā)生,127個周期出現(xiàn)多精受精,多精受精在DOR患者的周期發(fā)生率為31.83%(127/399)。正常受精組和多精受精組患者間女方年齡、不孕年限、不孕類型和基礎(chǔ)AFC比較均無顯著性差異比較(P>0.05);兩組間女方BMI正常和超重的比例亦無顯著性差異(P>0.05),而多精受精組中女方BMI為肥胖的比例顯著高于正常受精組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基礎(chǔ)資料比較[M(P25,P75),n(%)]

二、兩組患者COS相關(guān)指標(biāo)比較

兩組患者的Gn啟動劑量比較無顯著性差異(P>0.05);多精受精組的Gn天數(shù)、Gn總量、扳機日E2和孕酮水平、獲卵數(shù)均顯著高于正常受精組(P<0.05),扳機日LH水平則顯著低于正常受精組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的COS相關(guān)指標(biāo)比較[M(P25,P75),(-±s)]

三、Logistic回歸分析多精受精發(fā)生的影響因素

以是否發(fā)生多精受精為因變量(賦值1=是,0=否),以單因素分析中P<0.05的相關(guān)因素(包括BMI、Gn天數(shù)、Gn總量、扳機日E2和孕酮水平、扳機日LH水平及獲卵數(shù))為自變量,建立Logistic回歸模型。多精受精和BMI相關(guān)賦值情況詳見表3。

回歸分析結(jié)果顯示：Gn天數(shù)、Gn總量、扳機日E2、LH和孕酮水平未能進入回歸方程(OR值分別為1.059、1.000、1.000、0.958和0.780,P>0.05),提示這些因素對多精受精的發(fā)生無顯著影響;而女性BMI和獲卵數(shù)進入回歸方程(OR值分別為2.858、1.634,P值分別為0.020、0.000),提示這兩個因素顯著影響到多精受精的發(fā)生(P<0.05)(表4)。

表3 回歸啞變量賦值表

表4 多精受精發(fā)生影響因素的Logistic回歸分析

討 論

在IVF的實驗室操作中,多精受精的發(fā)生率在1%～10%[8]。目前的研究表明卵子的成熟度、加精時高精子濃度、卵子透明帶異常、卵泡液中高孕酮和高雄激素水平、體外操作過程中的環(huán)境因素等都可能導(dǎo)致多條精子進入卵母細(xì)胞[3,9-11]。本中心患者一律嚴(yán)格按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進行操作,以盡量減弱體外環(huán)境和實驗室人員操作對其多精受精的影響。為了避免精子情況對于多精受精的影響,本中心對加精濃度和授精時間都有嚴(yán)格把控。在本研究回顧性分析的399個DOR患者的常規(guī)IVF周期中,127個周期出現(xiàn)了多精受精,發(fā)生率為31.83%。

本研究結(jié)果表明在DOR人群中,多精受精組的肥胖人群比例顯著高于正常受精組(P<0.05),提示DOR患者中肥胖可能與多精受精有關(guān)。多精受精組的Gn天數(shù)、Gn總量、扳機日E2和孕酮水平、獲卵數(shù)均顯著高于正常受精組(P<0.05),扳機日LH水平則顯著低于正常受精組(P<0.05),同樣提示這些因素可能會導(dǎo)致DOR患者多精受精的出現(xiàn)。在隨后的多因素分析中,Logistic回歸結(jié)果表明Gn的使用情況、扳機日E2、孕酮和LH水平對DOR人群多精受精的發(fā)生無顯著影響(P>0.05),而獲卵數(shù)和肥胖則與多精受精的發(fā)生有關(guān),獲卵數(shù)越多則多精受精發(fā)生的可能性越大(OR=1.634,P=0.000)。DOR合并肥胖的患者發(fā)生多精受精的概率是BMI正常DOR患者的2.858倍(OR=2.858,P=0.020),提示肥胖和獲卵數(shù)是DOR患者發(fā)生多精受精的獨立危險因素。

在不孕不育癥的相關(guān)研究中,肥胖與不孕一直是熱點話題。有研究發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠的模型中,小鼠卵巢存在大量凋亡卵泡,卵母細(xì)胞體積變小,卵子成熟率降低[12]。李沛等[13]的報道中亦指出高BMI對卵子質(zhì)量和授精結(jié)果有負(fù)面影響。肥胖從多個方面影響卵母細(xì)胞,包括減數(shù)分裂時染色質(zhì)裝配異常,線粒體在結(jié)構(gòu)、空間、代謝方面的異常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常等,進而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量,導(dǎo)致多精受精的發(fā)生[14]。最近有研究顯示在短時間(3個月)內(nèi)盡快減重對助孕結(jié)局有益[15]。

獲卵數(shù)也是IVF多精受精的危險因素之一,這與我中心之前的報道以及其他相關(guān)報道[16-17]一致。有研究表明,過低或過高的獲卵數(shù)均會使卵母細(xì)胞的正常受精率降低,異常受精率增高[5]。但也有學(xué)者指出,卵母細(xì)胞質(zhì)量和受精率與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)[18],獲卵數(shù)越少卵母細(xì)胞質(zhì)量越高[19],但這些研究并不是針對DOR患者。對于DOR患者,她們本身的卵子數(shù)量較少,當(dāng)獲卵數(shù)相對較多時,本周期出現(xiàn)多精受精的概率也會隨之增加。當(dāng)然我們也不能排除由于獲卵數(shù)增加導(dǎo)致的多精受精概率升高的現(xiàn)象是單純的數(shù)學(xué)概率問題,其具體的機制仍需要后續(xù)進一步研究。

綜上所述,DOR合并肥胖顯著增加了常規(guī)IVF多精受精發(fā)生的概率。提示對此類患者行IVF助孕時應(yīng)及時進行預(yù)處理,包括改善生活方式、增加運動、降低BMI等,若減重困難,則可以考慮改變受精方式來減少多精受精的發(fā)生。但因本研究統(tǒng)計資料有限,僅針對DOR患者的基本情況以及促排卵情況進行了多因素分析;且由于BMI低于正常范圍人群的樣本量過少,相關(guān)數(shù)據(jù)未納入統(tǒng)計分析,故無法統(tǒng)計DOR合并低體重人群行常規(guī)IVF時多精受精的發(fā)生情況。