IVF/ICSI-ET術(shù)后早期妊娠丟失患者絨毛組織拷貝數(shù)變異異常的高危因素分析

黃蕾，何蕊，許曉雪，閆慧，趙君利，哈靈俠，劉春蓮*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川 750004)

早期妊娠丟失(early pregnancy loss,EPL) 是指妊娠12周內(nèi)胚胎停育、自然流產(chǎn)及生化妊娠等,占臨床確診妊娠的10%～20%,其中高達(dá)50 %與染色體異常有關(guān)[1]。近年來體外受精(IVF) /卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI) 技術(shù)成為提高不孕癥患者臨床妊娠率的重要手段,但術(shù)后EPL仍高達(dá)16.6%～18.3%[2],成為亟待解決的問題。拷貝數(shù)變異測(cè)序技術(shù)(copy number variation sequencing,CNV-seq) 作為一種低深度全基因組測(cè)序技術(shù),能夠提高胚胎染色體異常的診斷率,是EPL病因研究中最為重要的檢測(cè)手段之一[3-4]。本回顧性研究通過分析IVF/ICSI助孕后EPL患者絨毛組織的拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV) 結(jié)果,以及兩組患者一般臨床資料、臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),探尋可能的高危因素,以期指導(dǎo)臨床采取干預(yù)措施,提高IVF/ICSI助孕后的活產(chǎn)率。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2020年6月至2022年12月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF/ICSI-ET助孕后的EPL患者中絨毛組織CNV異常的周期作為病例組(n=29)。隨機(jī)抽選同期IVF/ICSI-ET助孕后正常活產(chǎn)的周期作為對(duì)照組(n=60)。

所有周期均為新鮮胚胎移植周期,排除資料不全者。

本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

二、診療回顧

1.IVF/ICSI-ET助孕：根據(jù)患者的自身情況選擇合適的卵巢刺激方案,包括標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案、超長(zhǎng)方案、短方案、拮抗劑方案及微刺激方案等。男方于取卵當(dāng)日采取手淫法取精,梗阻性無精子癥患者采用經(jīng)皮睪丸/附睪穿刺取精留取精液。依據(jù)精液質(zhì)量的不同,采用常規(guī)IVF或ICSI完成授精。取卵后3 d或5 d(D3/D5)選擇1～3級(jí)的卵裂期胚胎或3CC以上的囊胚期胚胎1～3枚進(jìn)行移植,移植后肌肉注射黃體酮60 mg/d給予黃體支持。移植后35 d行B超檢查,可見妊娠囊者為臨床妊娠。EPL定義為B超檢查可見妊娠囊,但妊娠12周前妊娠自然終止;活產(chǎn)定義為妊娠28周及以上娩出有生命體征的嬰兒。

2.CNV-seq：無菌條件下獲取EPL患者絨毛組織樣本,放至專用無菌標(biāo)本瓶?jī)?nèi)冷凍保存,送至山東貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行CNV-seq分析,送檢前患者均知情并簽署知情同意書。

檢測(cè)原理與方法：將收集的絨毛組織進(jìn)行核酸提取和純化;提取的人基因組用DNA酶切打斷,然后在其兩端添加測(cè)序接頭,通過磁珠分選富集20～500 bp大小的文庫(kù)片段,構(gòu)建測(cè)序文庫(kù);利用DNA納米球技術(shù)對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增,形成測(cè)序模板,通過基于聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)的基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序;利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到匹配到每條染色體上的有效序列數(shù)量,計(jì)算有效序列數(shù)量與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)染色體序列數(shù)量的比值,判斷染色體非整倍體異常。

結(jié)果解讀和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)DECIPHER(https：//www.deciphergenomics.org/)、在線人類孟德爾遺傳(OnlineMendelian Inheritance in Man,OMIM;https：//omim.org/) 數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)合患者表型進(jìn)行綜合分析;依據(jù)ACMG(2019) 指南對(duì)所有變異進(jìn)行致病性評(píng)級(jí),將所有變異分為5類：致病性、可能致病性、臨床意義未明、可能良性及良性;根據(jù)指南共識(shí)建議進(jìn)行結(jié)果報(bào)告,報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為染色體非整倍體、100 Kb以上已知明確致病的CNVs以及1 Mb以上的基因組缺失/重復(fù)。

3.移植胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分[5]對(duì)卵裂期胚胎評(píng)分：根據(jù)卵裂球數(shù)目、卵裂球均勻性和碎片比例等評(píng)分指標(biāo)將胚胎分為1～4級(jí),形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)為1～2級(jí)屬于優(yōu)質(zhì)胚胎,形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)為3～4級(jí)屬于非優(yōu)質(zhì)胚胎。(2)根據(jù)Gardner評(píng)分[6]方法對(duì)囊胚期胚胎評(píng)分：觀察指標(biāo)包括囊胚腔大小、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚的發(fā)育分為1～6期、根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分為A～C級(jí),根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞分為A～C級(jí),評(píng)為4、5、6(AA、AB、BA、BB) 的囊胚屬于優(yōu)質(zhì)囊胚,其他囊胚屬于非優(yōu)質(zhì)囊胚。

三、觀察指標(biāo)

患者一般資料,包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限/類型、孕產(chǎn)史、基礎(chǔ)激素水平;控制性促排卵相關(guān)資料,包括促性腺激素(Gn)天數(shù)/用量、Gn啟動(dòng)日及HCG日激素水平、內(nèi)膜狀況、獲卵數(shù)等;受精、胚胎培養(yǎng)及胚胎移植相關(guān)資料,包括受精方式、移植胚胎類型/數(shù)量/治療以及移植后14 d HCG水平等;病例組絨毛組織CNV-seq結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者基本資料

本研究納入了IVF/ICSI-ET助孕新鮮周期移植后EPL患者絨毛組織檢出CNV-seq結(jié)果異常的29個(gè)周期(病例組),以及同期IVF/ICSI-ET助孕新鮮周期移植后正常活產(chǎn)的60個(gè)周期(對(duì)照組)。

病例組患者的年齡、自然流產(chǎn)次數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而抗苗勒管激素(AMH)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05);兩組患者間BMI、不孕年限、不孕類型、基礎(chǔ)激素[卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)] 水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基本資料比較[(-±s),n(%)]

二、患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

病例組Gn啟動(dòng)日FSH水平、Gn啟動(dòng)日LH水平、HCG日LH水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);兩組患者間Gn啟動(dòng)日E2水平、Gn總天數(shù)、Gn總量、HCG日E2、孕酮(P)水平、HCG日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、受精方式、移植胚胎數(shù)、移植胚胎來源/類型/質(zhì)量及移植14 d后HCG水平比較,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

三、病例組患者絨毛CNV-seq結(jié)果

29例EPL患者絨毛CNV-seq結(jié)果異常樣本中,檢出染色體數(shù)目異常21例(72.41%),以常染色體三體最為常見,共16例(55.17%),其中16-三體共5例(17.24 %)、22-三體3例(10.34%),21、13、8-三體各2例(各占6.90%),18、20-三體各1例(各占3.45%);另有三倍體3例(10.34%)、Turner綜合征2例(6.90%)。

檢出染色體結(jié)構(gòu)異常(部分重復(fù)/缺失) 8例(27.59%),其中4例CNVs有明確致病性(13.79%)、2例CNVs提示可能致病(6.90%)、2例CNVs為臨床意義不明(6.90%)。

表2 患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[(-±s),n(%)]

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)(ART) 技術(shù)的發(fā)展,臨床妊娠率在過去十年中逐漸提高,但EPL仍是常見并發(fā)癥,染色體異常是其最重要原因[7]。盡管許多研究已經(jīng)評(píng)估了ART妊娠后EPL的危險(xiǎn)因素,但很少有研究比較EPL絨毛染色體異常患者與正常活產(chǎn)患者之間的差異。本回顧性研究通過分析討論高齡、卵巢儲(chǔ)備功能減退對(duì)EPL的致病機(jī)理,探索IVF/ICSI助孕后EPL胚胎染色體異常的高危因素,以期幫助醫(yī)生改進(jìn)方案,并就危險(xiǎn)因素向孕婦提供ART咨詢,最大限度地降低EPL的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究病例組平均年齡為(33.45±3.78)歲,顯著高于對(duì)照組的(29.52±4.27)歲(P<0.05)。Xu等[8]的研究中年齡被認(rèn)為是對(duì)妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)影響最大的變量;Eldin等[9]對(duì)195例ICSI周期治療后EPL患者進(jìn)行了回顧性研究,發(fā)現(xiàn)女性高齡會(huì)使EPL的風(fēng)險(xiǎn)增加約2.5倍。研究表明,35歲以上女性的卵母細(xì)胞質(zhì)量較差,胚胎移植后的妊娠率和活產(chǎn)率均低于年輕女性,這種低成功率被認(rèn)為與胚胎的非整倍體率的增加有關(guān)[10-12]。高齡增加胚胎非整倍體率的機(jī)制較為復(fù)雜,包括線粒體功能異常、端粒縮短、染色體粘連異常以及紡錘體穩(wěn)定性下降等,一方面可造成胚胎發(fā)育速率部分降低,另一方面則導(dǎo)致減數(shù)分裂染色體分離異常,最終顯著增加胚胎非整倍體率[13-15]。此外,高齡干擾子宮內(nèi)膜容受性,包括子宮內(nèi)膜的形態(tài)和功能改變,如膠原含量增加、基質(zhì)細(xì)胞組織中DNA含量減少、內(nèi)膜細(xì)胞中雌激素受體及子宮血流量減少等,均可對(duì)種植后的胚胎產(chǎn)生負(fù)面影響,導(dǎo)致EPL[16]。Fujii等[17]的研究表明高齡伴有子宮內(nèi)膜乳酸桿菌微生物群減少,而后者已證實(shí)與子宮內(nèi)膜容受性顯著相關(guān)。一項(xiàng)Meta分析僅納入了年輕卵母細(xì)胞捐贈(zèng)周期,作為研究高齡影響子宮內(nèi)膜容受性的一個(gè)科學(xué)模型,結(jié)果表明高齡是影響子宮內(nèi)膜容受性的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[18]。

AMH被認(rèn)為是卵巢儲(chǔ)備功能的重要標(biāo)志之一,其他重要指標(biāo)包括基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平以及竇卵泡數(shù)(AFC) 等。卵巢儲(chǔ)備功能減退(diminished ovarian reserve,DOR) 患者的卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量減低,即使采ART助孕,活產(chǎn)率仍然較低[19]。在本研究中,病例組的AMH平均值為(2.49±2.05) ng/ml,顯著低于對(duì)照組[(4.03±2.67)ng/ml],這與Atasever等[20]的報(bào)道結(jié)果一致。一項(xiàng)Meta分析表明DOR與EPL有顯著相關(guān)性[21];Tan等[22]研究表明AMH水平與流產(chǎn)率呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.154,P<0.001)。Jiang等[23]發(fā)現(xiàn)年齡大于35歲且AMH水平較低的女性,非整倍體比例也顯著升高;Arnanz等[24]的研究也表明AMH水平低與高齡產(chǎn)婦非整倍性風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān);Jaswa等[25]通過控制接受IVF助孕的DOR患者的年齡,發(fā)現(xiàn)DOR患者囊胚活檢的整倍體率較非DOR患者降低了24%。還有研究表明,DOR患者的卵泡微環(huán)境受到氧化應(yīng)激損傷,從而對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降[26]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于DOR與胚胎非整倍體形成機(jī)制的研究相對(duì)較少,未來需要更多的研究進(jìn)一步探索。

染色體數(shù)目異常是EPL最常見的原因[27]。在我們所納入EPL病例的流產(chǎn)絨毛樣本中,發(fā)現(xiàn)的染色體異常大部分(72.41%)是數(shù)目異常,其中主要的為常染色體三體(55.17%),其中16-三體和22-三體最常見(分別為17.24 %和10.34%),這與Zhu等[28]的研究結(jié)果一致。既往報(bào)道減數(shù)分裂重組、染色體凝聚力減弱、異常端粒結(jié)構(gòu)可能是造成染色體數(shù)目異常的原因[29],而常染色體三體的發(fā)生通常是因?yàn)樵跍p數(shù)分裂時(shí)同源染色體或姐妹染色單體不分離,其中近端著絲粒染色體(13、14、15、16、21和22號(hào)染色體)最容易發(fā)生減數(shù)分裂失敗而形成三體[30-31]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于16-三體發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究中,有報(bào)道證實(shí)特定基因的啟動(dòng)子高度甲基化,可能導(dǎo)致表達(dá)減少、滋養(yǎng)細(xì)胞分化及有絲分裂障礙、染色體嵌合,進(jìn)而通過三體拯救等機(jī)制進(jìn)行自我糾正[32]。Yao等[33]通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),免疫功能相關(guān)分子如人白細(xì)胞抗原(HLA)-G、HLA-C、IgG受體Fc片段Ⅲ等,及胚胎植入和發(fā)育相關(guān)分子與16-三體誘導(dǎo)早期胚胎死亡有關(guān)。有研究使用單核苷酸多態(tài)性陣列和CNV測(cè)序?qū)Ψ磸?fù)妊娠丟失(RPL)患者流產(chǎn)組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)16q24.3和16p13.3的重復(fù)明顯更頻繁(P<0.05),因此被認(rèn)為與RPL有關(guān)[34]。此外,亦有inv(16)(p13q22)染色體核型導(dǎo)致急、慢性髓性白血病的病例報(bào)道[35]。因此16號(hào)染色體異常與不良孕產(chǎn)史顯著相關(guān)。

本研究提示高齡、卵巢儲(chǔ)備功能減退是IVF/ICSI-ET術(shù)后胚胎染色體異常的重要影響因素,對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行CNV-seq分析,可以幫助尋找可能的致病因素,避免再次發(fā)生EPL。EPL患者下次助孕前建議對(duì)染色體核型進(jìn)行重新分析,排除“隱匿性染色體異常”的可能性,并可采取子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)(endometrial receptivity test,ERT) 及胚胎植入前遺傳學(xué)非整倍體檢測(cè)(PGT-A) 技術(shù),加上孕期嚴(yán)密產(chǎn)檢,以提高活產(chǎn)率并降低出生缺陷率。本研究同時(shí)也存在一些不足之處：首先,樣本量不夠大,容易導(dǎo)致結(jié)果偏差;其次,由于該研究是回顧性的,因此無法研究其他相關(guān)因素,且這是一項(xiàng)單中心研究,結(jié)果的普遍性有限。希望在后續(xù)的研究中進(jìn)行一些病例的積累,擴(kuò)大樣本量,細(xì)化各項(xiàng)指標(biāo),進(jìn)行更加系統(tǒng)的分析,為EPL患者絨毛CNV異常的高危因素研究提供更有力的支持。