雙酚A暴露對不同卵巢儲備狀態(tài)女性優(yōu)質胚胎率的影響

高敏，迪麗尼格爾·阿吉阿布都拉，羅杰，高義凡，杜麗麗，黃凱，沈豪飛，2，谷旭照，賈天玉，2*，王一青，2，3*

(1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院,蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫(yī)院,蘭州 730000;3.甘肅省生殖醫(yī)學與胚胎重點實驗室,蘭州 730000)

人類生產(chǎn)活動過程中大量有毒有害物質被排入外界環(huán)境,不僅對環(huán)境造成了污染破壞也對人類自身造成了嚴重的安全隱患。其中有一類可以改變內分泌系統(tǒng)功能從而對生物體及其后代造成不良影響的物質被世界衛(wèi)生組織定義為環(huán)境內分泌干擾物[1],這類物質可表現(xiàn)出雌激素活性或抗雌激素活性進而影響女性生殖系統(tǒng),導致月經(jīng)周期不規(guī)律、生育力降低、多囊卵巢綜合征(PCOS)、子宮內膜異位癥、卵巢早衰、性早熟和不良妊娠結局等多種生殖問題[2-4]。雙酚A(bisphenol A,BPA)作為一種常見的工業(yè)原料被廣泛用于各種工業(yè)用品的生產(chǎn)且在空氣、水源、土壤中均被檢測到,在人類的生物樣本中如血清、尿液、胎盤組織、乳汁中也發(fā)現(xiàn)其存在[5-6]。

BPA通過攝食、吸入和皮膚接觸等方式進入人體,通過與雌激素受體α、β及雌激素相關受體γ結合來模擬雌激素從而干擾性激素的正常釋放和起效,影響女性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能[7-8]。研究表明,BPA暴露可導致雌性發(fā)情周期異常、妊娠率降低、類固醇激素如雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)分泌紊亂,并且Star、Cyp11a1、Cyp17a1等激素合成相關酶的表達也出現(xiàn)失調[9-10]。卵巢作為女性重要的生殖器官對其生育年限具有決定性作用,任何對卵巢的損傷都有可能對其生育力甚至后代產(chǎn)生嚴重影響。卵巢儲備功能減退(DOR)和PCOS表現(xiàn)為卵泡數(shù)量的兩個極端,體現(xiàn)出不同的卵巢儲備狀態(tài),為了探究BPA在不同卵巢儲備狀態(tài)人群內的暴露水平與其優(yōu)質胚胎率的關系,本研究檢測了卵巢儲備功能正常(NOR)、DOR及PCOS患者卵泡液內BPA濃度并進行了相關于體外受精周期中優(yōu)胚率的分析。

資料和方法

一、研究對象

2022年1—6月于蘭州大學第一醫(yī)院生殖中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的患者。

納入標準：臨床信息記錄完整;采用高孕激素狀態(tài)下促排卵(progestin primed ovarian stimulation,PPOS)方案;有凍存卵泡液樣本的NOR、DOR和PCOS病例。

DOR診斷標準[11-12]：月經(jīng)第2～3天卵泡刺激素(FSH)≥10 U/L,抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml,竇卵泡計數(shù)(AFC)<5～7個;滿足以上兩項。PCOS診斷標準[13-14]：具有雄激素過多的臨床癥狀,稀發(fā)排卵或無排卵,卵巢多囊樣改變即一側卵巢存在12個及以上直徑為2～9 mm的卵泡;滿足以上兩項。

排除標準：腹腔手術史;年齡大于40歲;子宮內膜異位癥史;染色體異常;3個月內有抗生素治療史;甲狀腺疾病史;自身免疫性疾病史。

共納入了符合標準的164例患者,其中NOR組80例、DOR組39例、PCOS組45例。

本研究經(jīng)蘭州大學第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(LDYYLL2022-95)。

二、研究方法

1.主要試劑與設備：雙酚A ELISA檢測試劑盒(江蘇晶美生物);離心機(上海盧湘儀);酶標儀(帝肯,瑞士)。

2.卵泡液樣本采集：本研究納入病例均采用PPOS促排卵方案,于月經(jīng)第2～4日口服甲羥孕酮片(MPA,每片2 mg;浙江仙據(jù)制藥) 10 mg/d,同時肌肉注射尿促性腺激素(HMG,每支75 U;珠海麗珠制藥)150～300 U/d,經(jīng)陰道超聲檢查卵泡發(fā)育,根據(jù)E2、黃體生成素(LH)、P水平及卵泡大小皮下注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,每支2 000 U;珠海麗珠制藥) 6 000～10 000 U。HCG注射36 h后取卵。收集第一管清亮、未染血的卵泡液,3 000 r/min離心15 min,吸取上清液分裝后放置于-80℃冰箱保存。

3.受精/胚胎培養(yǎng)及評級：取卵后根據(jù)男方精液情況選擇常規(guī)體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)進行授精,16～18 h后觀察到有雙原核(2PN)即為受精成功。受精3 d后,卵裂期胚胎根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)、有無多核及碎片程度進行胚胎評級,分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級。優(yōu)質胚胎為Ⅰ級和Ⅱa級的胚胎,即卵裂期胚胎細胞數(shù)為6～8個、分裂均勻、碎片≤25%且無多核者[15]。優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%。

4.BPA檢測：采用商用試劑檢測盒(江蘇晶美生物),在標準孔內分別加入0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb標準品溶液50 μl;將卵泡液樣本解凍至室溫,在樣品孔內加入50 μl卵泡液;在所有孔內加入50 μl抗BPA抗體酶結合物并輕輕晃動反應板;37℃孵育30 min后棄去孔內液體,用洗滌液清洗各個反應孔后完全除去孔內液體;在每孔內依次加入50 μl顯色液A和50 μl顯色液B,晃動混勻;37℃孵育10 min后每孔加入50 μl終止液,混勻,使用酶標儀在450 nm下檢測吸光度。

三、觀察指標

患者一般資料,包括年齡、體質量指數(shù)(BMI)、不孕年限、初潮年齡、月經(jīng)周期、基礎激素水平(包括FSH、LH、E2)及AMH水平、AFC;獲卵數(shù);卵泡液BPA檢測結果;受精方式及胚胎培養(yǎng)結局。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、不同人群組基本臨床資料

本研究共納入了164例病例,其中NOR組80例、DOR組39例、PCOS組45例。

與NOR組比較,PCOS組年齡較小、而DOR組年齡較大(P<0.05);與DOR組比較,PCOS組年齡較小(P<0.05)。3組間BMI、不孕年限、月經(jīng)初潮年齡比較無顯著差異(P>0.05),而PCOS組月經(jīng)周期天數(shù)顯著長于NOR組和DOR組(P<0.05)。3組間AMH和基礎FSH水平比較均有顯著差異(P<0.05),其中PCOS組AMH最高而基礎FSH水平最低,DOR組AMH水平最低而基礎FSH水平最高。PCOS組基礎LH水平顯著高于NOR組和DOR組(P<0.05)。3組間基礎E2水平比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

3組間AFC、獲卵數(shù)比較均有顯著差異(P<0.05),其中PCOS組最高、DOR組最低。3組間受精方式占比無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組人群基本臨床資料[(-±s),M(Q1,Q3),%]

二、不同人群卵泡液中BPA暴露水平

本研究共收集了164份卵泡液樣本,其中NOR組80份、DOR組39份、PCOS組45份。PCOS組卵泡液BPA含量顯著高于DOR組(P<0.05);DOR組和PCOS組卵泡液BPA含量與NOR組比較均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 三組人群卵泡液內BPA水平

三、不同人群BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系

1.NOR組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系：納入NOR病例80例,其對應的卵泡液中BPA濃度根據(jù)四分位數(shù)法分為Q1(0.02～0.97)、Q2(1.31～5.28)、Q3(5.91～9.12)、Q4(9.50～12.25)亞組。NOR組各BPA濃度亞組間優(yōu)質胚胎率存在顯著差異(P=0.027),其中Q2亞組相較于Q1亞組優(yōu)質胚胎率顯著下降(P<0.05)(表3)。

表3 NOR組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系

單因素Logistic回歸分析顯示NOR組卵泡液BPA水平對優(yōu)質胚胎率無顯著影響[OR(95%CI)=1.02(0.96,1.08),P=0.589 7]。

2.DOR組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系：納入DOR病例39例,其對應的卵泡液中BPA濃度根據(jù)四分位數(shù)法分為Q1(0.02～1.27)、Q2(1.63～4.76)、Q3(6.19～8.87)、Q4(9.94～12.03)亞組。DOR組間各BPA濃度亞組間優(yōu)質胚胎率無顯著差異(P=0.488)(表4)。

單因素Logistic回歸分析顯示DOR組卵泡液BPA水平對優(yōu)質胚胎率無顯著影響[OR(95%CI)=0.95(0.86,1.04),P=0.278 3]。

表4 DOR組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系

3.PCOS組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系：納入PCOS病例45例,其對應的卵泡液中BPA濃度根據(jù)四分位數(shù)法分為Q1(0.56～1.25)、Q2(1.33～5.67)、Q3(6.78～9.00)、Q4(9.35～12.52)亞組。PCOS組各BPA濃度亞組間優(yōu)質胚胎率存在顯著差異(P=0.004),其中Q2和Q4組相較于Q1組優(yōu)質胚胎率均有顯著下降(P<0.05)(表5)。

表5 PCOS組卵泡液BPA水平與優(yōu)質胚胎率的關系

單因素Logistic回歸分析顯示PCOS組卵泡液BPA水平對優(yōu)質胚胎率無顯著影響[OR(95%CI)=0.96(0.88,1.04),P=0.314 1]。

討 論

BPA可用于制造聚碳酸樹脂和環(huán)氧樹脂,而這些物質被大量用于塑料袋、食品外包裝(如罐頭內層)、醫(yī)療器械、熱敏紙的生產(chǎn)[16-18]。它的主要攝入途徑是飲食,并可在運輸及儲存過程中經(jīng)食品容器滲入食物中,而加熱和酸性環(huán)境則會加快該過程,一旦其進入人體便可經(jīng)胃腸道吸收,在肝臟代謝,最終從尿液排出[19-20]。雌激素可調控胚胎在發(fā)育過程中靶器官的功能,若在胎兒期和圍產(chǎn)期這兩個窗口期受到具有雌激素活性的BPA的污染便會導致其個體成年后的生殖損傷[21],這一依據(jù)使得研究BPA早期暴露與女性生殖疾病的關系具有重要意義。卵泡液作為卵泡生長的微環(huán)境,可更直觀地研究卵泡生長發(fā)育過程中的影響因素,因此有必要對不孕女性卵泡液內的BPA暴露程度進行研究。

PCOS是一種育齡期女性常見的內分泌紊亂疾病,全球發(fā)病率約為6%～20%,表現(xiàn)為胰島素抵抗、多毛、肥胖、卵巢多囊化、月經(jīng)不規(guī)律[22]。患者較低的FSH水平會抑制卵泡的成熟,導致卵泡生長停滯、多囊化卵巢形成和少或無排卵,同時大量被抑制生長的竇前卵泡使得AMH水平升高,進一步導致高雄激素血癥[23]。而DOR患者由于較低的卵巢反應常被認為是輔助生殖治療中的一大難題,其最明顯的特征是卵泡儲備數(shù)量減少并表現(xiàn)出FSH水平升高和AFC及AMH水平的降低[24]。這兩類人群的卵泡儲備數(shù)量表現(xiàn)為兩個極端,體現(xiàn)出兩種不同的卵巢儲備狀態(tài),并且她們的激素水平也有著很大的差異。我們的研究結果體現(xiàn)了這些特點。

Prabhu等[25]在最近的研究中發(fā)現(xiàn),PCOS人群的血漿BPA水平顯著高于對照組人群[(4.1±1.3) μg/g_cr vs.(3.3±1.2) μg/g_cr,P<0.05],且相較于低水平BPA暴露女性,高水平BPA暴露女性體內的類固醇激素、亞麻酸、亞油酸等物質的合成出現(xiàn)了紊亂。在另一項針對青少年人群的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)PCOS組BPA水平相較于正常人群顯著增高[(15.89±1.16)μg/g_cr vs.(7.30±1.38)μg/g_cr,P<0.05][26]。在本研究中,PCOS組卵泡液的BPA濃度高于NOR組和DOR組,這與上述研究的結果相似。此前已有研究表明BPA可通過增加P450c17、P450scc、Star等類固醇激素合成相關酶的表達,影響卵巢卵巢類固醇激素的生成,而這些酶也與PCOS表現(xiàn)出來的高雄激素血癥有關[27-28]。另一方面,BPA也與肥胖和胰島素抵抗有著密切的關系,它可通過擾亂正常的脂質與葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變機體的代謝,而這種效應甚至可以影響其子代。研究顯示,BPA濃度與超重和肥胖風險呈正相關,相較于非肥胖人群,肥胖人群體內的BPA濃度更高,而且女性比男性表現(xiàn)得更加明顯[29-30]。同時,長期暴露于BPA會導致葡萄糖穩(wěn)態(tài)的失調,使胰島素慢性高分泌降低葡萄糖水平并隨后出現(xiàn)胰島素抵抗[31],以上這些代謝綜合征正是PCOS人群常見的癥狀。此外在關于DOR人群研究中顯示DOR組體內的BPA含量顯著高于對照組[(1.89±2.17)μg/g vs.(1.58±1.08)μg/g,P<0.05],且在45歲以下的女性中BPA濃度與AMH呈負相關[32]。AMH作為目前評估卵巢儲備功能的生物標志物,其濃度的降低與卵巢低反應性有關,DOR人群中BPA濃度的升高也在某種程度上說明了其與卵巢衰老的相關性[33]。另一項關于早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)人群的調查同樣顯示POI人群的BPA水平要略高于正常人群[34]。并且BPA暴露可通過提高卵巢顆粒細胞ROS生成水平、促進Ca2+積累、降低抗氧化能力、誘導細胞凋亡和自噬等多種機制造成卵巢激素分泌紊亂和排卵功能障礙[35-37]。

本研究分析了在不同卵巢儲備功能人群中BPA濃度與優(yōu)質胚胎率的關系,盡管結果顯示BPA濃度與優(yōu)質胚胎率無顯著的相關性,但是在NOR人群和PCOS人群的亞組分析中發(fā)現(xiàn),相較于卵泡液BPA濃度更低的人群,BPA濃度更高者的優(yōu)質胚胎率出現(xiàn)了顯著下降。有研究者收集了接受IVF治療的女性的尿液樣本,并在后續(xù)的分析中發(fā)現(xiàn)隨著尿液中BPA濃度的增高,卵母細胞回收率、成熟率和胚胎著床率顯著降低[35]。在Ehrlich等[38]的報道中,BPA濃度增加與成熟卵母細胞減少和受精率降低也存在顯著的線性劑量關系。而在另一項研究中則顯示尿BPA濃度與胚胎著床率和MⅡ卵母細胞數(shù)顯著負相關,與優(yōu)質胚胎、受精率、妊娠率無顯著相關[39]。在體外試驗中,BPA暴露可顯著抑制卵泡生長、降低竇狀卵泡百分比、減少卵母細胞成熟率并增加閉鎖卵泡率,這些改變可能與卵母細胞減數(shù)分裂后期紡錘體異常、染色體排列錯誤、減數(shù)分裂停止甚至非整倍體形成有關[40-42]。這些數(shù)據(jù)都表明BPA對于胚胎存在著一定的不良影響。此外,在本研究中,NOR組與DOR組的卵泡液BPA含量并無顯著差異,而PCOS組的BPA含量則顯著升高,而且在DOR組各BPA濃度亞組間優(yōu)胚率并未觀察到顯著差異,這也提示或許不同卵巢儲備狀態(tài)的人群對于BPA的易感度也有所差異。

考慮到BPA較短的半衰期,為了提供更加精準的結果,在開展相關研究時應注意樣本收集的窗口期及受試者近期攝入BPA的情況。同時考慮到某些特殊職業(yè)人群(如收銀員)會日常接觸BPA,應針對該類人群盡早實施防護措施,減少BPA對公共健康安全的危害。

綜上所述,BPA作為一種毒性物質對女性生殖健康的威脅不容忽視,積極研究其對女性生殖疾病的關聯(lián)與損傷機制并加強對該物質的風險管理對保障女性生殖健康具有重要的科學意義和社會意義。