CXCR2基因敲除HeLa細胞株構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序分析

刁思雨，王家銀，高春海，王言言，訾臣*，關(guān)向宏*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)臨沂市人民醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,臨沂 276034;2.臨沂市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心,臨沂 276034)

子宮頸癌是女性最常見的腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌,也是全球女性癌癥患者死亡的第二大原因[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)的感染尤其是高危HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的高危因素,90%以上的宮頸癌伴有高危型HPV感染[2]。盡管開展了很多分子功能研究,宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機制仍尚未確定。趨化因子(Chemokine)是由免疫細胞產(chǎn)生的有趨化作用的細胞因子,可分為CXC類、CC類、C類及CX3C類,在腫瘤、血管生成及炎癥等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。趨化因子受體CXCR2是CXC類趨化因子的受體,有研究顯示CXCR2是在體內(nèi)優(yōu)化角化細胞生長和刺激腫瘤細胞生長、存活和運動所必需的因子之一[3]。有Meta分析顯示CXCR2水平與癌癥治療后生存期有關(guān)[4]。CXCR2與黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的肝細胞癌的進展與預(yù)后相關(guān)[5-7]。CXC類趨化因子配體1或8(CXCL1/8)與CXCR2組成的信號軸(CXCL1/8-CXCR2軸)通過募集腫瘤相關(guān)中性粒細胞促進了結(jié)直腸癌的發(fā)展[8]。CXCR2在腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)過程中發(fā)揮作用,主要體現(xiàn)在對血管生成、淋巴管生成、細胞衰老,以及腫瘤微環(huán)境等的調(diào)控方面[9]。本研究利用成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9(CRISPR-Cas9)基因編輯技術(shù)獲得CXCR2基因敲除的人宮頸癌HeLa細胞,利用轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選CXCR2和宮頸癌相關(guān)的功能基因,為探討CXCR2在調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制方面提供依據(jù)。

材料和方法

一、主要試劑及儀器

人宮頸癌HeLa細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫;pGK1.2質(zhì)粒購自南京吉銳生物,該質(zhì)粒載體包含Cas9核酸酶表達框和向?qū)NA(gRNA)克隆框,以及綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性標記;BbsI酶購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)購自北京唯尚立德生物科技有限公司;Opti-MEM培養(yǎng)液、DMEM完全培養(yǎng)液、lip2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;2×Mastermix PCR反應(yīng)液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;基因組DNA提取試劑盒和高純度質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

二、載體構(gòu)建及鑒定

利用在線設(shè)計軟件(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/),針對CXCR2基因CDS區(qū)第1個外顯子的起始密碼子附近設(shè)計單向?qū)NA(sgRNA)序列(具體信息詳見表1),委托上海生工生物工程有限公司合成oligos序列。

表1 sgRNAs序列信息

DNA雙鏈合成：上下游oligos(10 μmol/L)各5 μl、2 μl 10×退火緩沖液,補足ddH2O至20 μl,95℃變性5 min,按5℃/min降溫循環(huán)15次到20℃,退火形成DNA雙鏈。同時用BbsI酶37℃處理pGK1.2質(zhì)粒1 h,凝膠電泳純化獲得線性載體。10 μl退火產(chǎn)物、50 ng線性化載體、1 μl T4連接酶,2 μl 10×T4 Buffer,補足ddH2O至20 μl,16℃連接過夜。取10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,利用含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)皿37℃恒溫培養(yǎng)24 h。8 μl菌懸液、上下游引物各1 μl(上游引物：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’,下游引物為表1中的下游oligos),10 μl 2×Mastermix,PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min;95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s,35個循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。PCR擴增陽性的菌懸液,提取質(zhì)粒并測序驗證,測序引物：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’,對測序正確的菌株進行高質(zhì)量質(zhì)粒提取,提取方法參照試劑盒說明書。

三、Cas9重組載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞并篩選敲除細胞株

6孔板中HeLa細胞培養(yǎng)至密度約為70%時,換無血清Opti-MEM培養(yǎng)液1 ml。4 μg lip2000轉(zhuǎn)染試劑加入到100 μl Opti-MEM中,輕輕混勻靜置5 min,2.0 μg重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別加入到另外的100 μl Opti-MEM中,將含轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)液輕柔充分混勻,室溫放置20 min,加入細胞培養(yǎng)板中并混勻。含有重組質(zhì)粒的處理細胞定義為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,含對照質(zhì)粒的處理細胞定義為對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入2 ml新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞轉(zhuǎn)染24 h后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞均換上含有嘌呤霉素(1 μg/ml)的DMEM完全培養(yǎng)液,每24 h更換1次,直至對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中無活性細胞,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞增長一定數(shù)量后,收集細胞后取其中一部分用于提取DNA(提取方法參照試劑盒說明書)進行PCR和T7E1酶切檢測,另一部分細胞采用有限稀釋法培養(yǎng)單克隆細胞株。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min;95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s,35次循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。分別取5 μl PCR產(chǎn)物、10×T7E1 Buffer 1.1 μl、4.4 μl ddH2O,加入200 μl反應(yīng)管,經(jīng)95℃ 5 min變性反應(yīng);95℃ 2 s;-0.1℃/cycle,200 cycles;75℃ 1 s;-0.1℃/cycle,600 cycles;16℃ 2 min退火反應(yīng)。然后分別加入0.5 μl T7E1酶,37℃反應(yīng)30 min,立刻用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析結(jié)果,同時PCR產(chǎn)物測序驗證敲除效果。選用具有靶向敲除活性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組所獲得的單克隆細胞株,提取DNA再次PCR擴增后測序驗證并分析敲除效果,對CXCR2基因確定敲除的HeLa細胞株進行擴大培養(yǎng)。

四、轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異mRNA

將CXCR2基因敲除的HeLa細胞與正常HeLa細胞同時分別培養(yǎng)于6孔板,各設(shè)3個重復(fù),待細胞長滿皿底收集細胞提取總RNA,去除rRNA并片段化處理。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,修復(fù)末端,加A堿基修飾,加入接頭,進行RCR擴增,利用illumina平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。用已知的參考基因序列以及注釋文件做為數(shù)據(jù)庫,采取序列相似性比對的方法鑒定出各基因在各樣本中的表達豐度。使用htseq-count軟件計算樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數(shù),再根據(jù)FPKM公式計算基因表達量的FPKM值。利用DESeq2軟件對各個樣本基因的表達量進行標準化處理并計算差異倍數(shù),并采用負二項分布檢驗的方式進行差異顯著性檢驗,最終根據(jù)差異倍數(shù)(foldchange)大于2及差異顯著性檢驗結(jié)果(q<0.05,q值為校正后的P值)來篩選差異蛋白編碼基因。

五、差異基因功能分析和實時熒光定量PCR驗證

對差異表達基因進行基因本體(GO)富集分析,統(tǒng)計每個GO條目中所包括的差異基因個數(shù),并用超幾何分布算法計算差異基因富集的顯著性。利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異蛋白編碼基因進行Pathway分析,并分析差異基因富集的顯著性。通過差異基因功能分析,結(jié)合基因表達差異情況和生物學(xué)功能確定重要候選基因。

篩選出與腫瘤相關(guān)的基因,Genbank數(shù)據(jù)庫查找轉(zhuǎn)錄序列,并利用在線軟件PrimerBlast進行引物設(shè)計,委托上海生工生物工程有限公司合成(各引物序列信息詳見表2)。提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,按照1st strand cDNA合成反應(yīng)過程,配制10 μl的反應(yīng)液,分別加入Random 6 mers 0.8 μl、dNTP Mixture 1 μl、Template RNA 3 μl、RNase Free dH2O 5.2 μl,混勻后65℃保溫5 min后,冰上迅速冷卻。分別加入5×PrimeScript Buffer 4 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、PrimeScript RTase 1 μl、RNase Free dH2O 4.5 μl,混勻后,30℃ 10 min,42℃ 60 min,95℃ 5 min,迅速冷卻后備用。Real-Time PCR反應(yīng)液,10 μl 2×Super Real PreMix Plus、0.6 μl正向引物(100 μmol/L)、0.6 μl反向引物(100 μmol/L)、1 μl cDNA、0.4 μl 50×ROX Reference Dye、7.4 μl RNase-Free ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃ 15 min;95℃ 10 s、60℃ 32 s,40次循環(huán);分析熔解曲線。檢測結(jié)果經(jīng)2-ΔΔCt計算,并利用SPSS 23.0軟件進行最小顯著差異(LSD)t檢驗分析基因表達差異情況。

表2 熒光定量PCR引物信息

結(jié) 果

一、載體構(gòu)建及驗證

構(gòu)建好的質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α并培養(yǎng)獲得抗性菌落,每個培養(yǎng)平板上挑取2個單克隆菌落直接進行PCR反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證,顯示獲得目的片段長度118 bp的電泳條帶,提示PCR擴增成功(圖1A)。相應(yīng)的菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行測序,測序結(jié)果顯示靶向CXCR2基因起始密碼子附近的序列成功插入pGK1.2質(zhì)粒(圖1B),獲得靶向敲除CXCR2基因的sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4、sgRNA-5重組pGK1.2質(zhì)粒載體。

二、基因敲除細胞株

經(jīng)含有嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,多數(shù)細胞發(fā)生凋亡,活性細胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光(圖2),說明轉(zhuǎn)染及抗性表達成功。

含嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)直至對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中無活性細胞后,采用完全培養(yǎng)基對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組擴大培養(yǎng),并收集細胞提取DNA進行PCR檢測,PCR產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶處理后進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果提示sgRNA-1和sgRNA-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組具有靶向CXCR2敲除作用(圖3A);擴增產(chǎn)物經(jīng)Sanger測序分析顯示,在起始密碼子下游存在明顯重疊峰(圖3B),提示成功獲得CXCR2基因序列靶向修飾的多克隆細胞,可用于單克隆敲除細胞株的篩選。

采用有限稀釋法培養(yǎng)sgRNA-1和sgRNA-2重組載體處理后的細胞,獲得單克隆細胞株,擴大培養(yǎng)后收集提取DNA,經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)物進行測序驗證,與原始序列比對,篩選基因序列發(fā)生改變并引起移碼和翻譯提前終止的細胞株作為備用。

三、差異基因篩選、功能分析及驗證

CXCR2基因缺失細胞株經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序獲得差異表達基因1 519個(q<0.05,foldchang>2),其中上調(diào)表達基因428個,下調(diào)表達基因1 091個。對差異表達基因進行GO分析(圖4),共匹配到2 793個條目,其中顯著富集統(tǒng)計到262個條目(P<0.05),分別有47個涉及細胞組分,153個涉及生物學(xué)過程,62個涉及分子功能。GO富集數(shù)量前20的條目中涉及細胞組分、生物學(xué)過程、分子功能的分別有9個、6個和5個。提示CXCR2基因功能的缺失,可能在多個功能方面產(chǎn)生影響。

A：菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：M為DNA marker DL2000,1-1、1-2～5-1、5-2分別為sgRNA-1～5退火生成的DNA雙鏈與pGK1.2質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌的菌落PCR產(chǎn)物,目的片段長118 bp;B：質(zhì)粒載體的Sanger測序圖：sg1～5分別為sgRNA-1～5重組pGK1.2質(zhì)粒的測序圖,框中序列為各sgRNAs的上游DNA序列。圖1 載體PCR凝膠電泳和測序驗證

sg1～5分別為sgRNA-1～5重組pGK1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并經(jīng)嘌呤霉素篩選后的HeLa細胞,上下對應(yīng)的圖片分別為同一區(qū)域的綠色熒光視野和可見光視野。圖2 敲除載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞熒光表達

A：PCR擴增經(jīng)T7E1酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA marker DL2000,1～7分別代表sgRNA-1～5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選處理樣本、混合樣本及對照樣本,PCR產(chǎn)物片段長度為212 bp;圖中箭頭指向的是T7E1酶切片段,說明PCR序列中存在突變,提示存在基因靶向修飾;B：PCR擴增產(chǎn)物的Sanger測序圖。sg1、sg2分別代表sgRNA-1、sgRNA-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選處理樣本,control是未經(jīng)任何處理的對照細胞樣本;與對照相比,sg1、sg2測序圖存在明顯的重疊峰,提示存在基因靶向修飾。圖3 酶處理和測序驗證靶向基因修飾效果

圖4 差異表達基因的GO富集分析

對差異表達基因進行KEGG分析,共富集到291個通路,其中顯著富集42個(P<0.05),差異基因占比最高的前3種通路類型為感染相關(guān)通路、信號傳導(dǎo)通路和腫瘤相關(guān)通路(圖5)。KEGG通路富集基因最多的為腫瘤相關(guān)通路,其次為PI3K-Akt信號通路,第三為HPV感染信號通路,該通路共富集到38個差異基因,另外還有MAPK信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用通路等。KEGG分析結(jié)果進一步明確了CXCR2在癌癥中的作用,另外提示了其在HPV感染過程中發(fā)揮作用。

通過韋恩圖分析(詳見圖6A),獲得了腫瘤相關(guān)通路(hsa05200)、PI3K-Akt信號通路(hsa04151)和HPV感染信號通路(hsa05165)這3個主要信號通路的7個共同差異表達基因：EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB、CDKN1A,其中前6個基因表達顯著下調(diào),CDKN1A表達顯著上調(diào)。差異基因經(jīng)實時熒光定量PCR方法驗證(圖6B),結(jié)果顯示與測序結(jié)果(圖6C)差異變化趨勢一致。

圖5 差異表達基因的pathway富集分析

A：韋恩分析圖：腫瘤相關(guān)通路(hsa05200)51個差異基因,PI3K-Akt信號通路(hsa04151)40個差異基因,HPV感染信號通路(hsa05165)38個差異基因,進行韋恩圖分析得到7個差異基因;B：實時熒光定量PCR方法驗證差異基因：KO為CXCR2基因敲除細胞樣本,NC為對照細胞樣本,*P<0.05,**P<0.01;C：差異基因的轉(zhuǎn)錄組測序FPKM相對水平：KO、NC同B圖,#q<0.05。轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR方法檢測結(jié)果均顯示：與對照組相比,EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB在CXCR2基因敲除細胞中表達顯著下調(diào),CDKN1A表達顯著上調(diào)。圖6 關(guān)鍵差異基因的篩選和驗證

討 論

趨化因子在激活與宮頸癌進展相關(guān)的免疫檢查點調(diào)節(jié)因子中起著關(guān)鍵作用,并與腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成、化療抵抗和免疫抑制的預(yù)后有關(guān)[10]。CXCR2參與腫瘤干細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、化學(xué)抗性以及干細胞的干性和細胞表型維持,抑制CXCR2或其下游信號通路可顯著延緩腫瘤進展[11]。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得CXCR2基因敲除的HeLa細胞株,并經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序獲得了與CXCR2基因功能和腫瘤機制相關(guān)的候選功能基因以及信號調(diào)控通路。本研究關(guān)注并分析了富集最多的3個信號通路,獲得7個共同差異基因。其中下調(diào)表達的6個基因的功能包括了細胞生長增殖分化、細胞黏附轉(zhuǎn)移、細胞周期調(diào)控等,上調(diào)表達的CDKN1A基因參與p53依賴的細胞周期G1期阻滯,這些功能基因的表達失控均與癌癥機制有關(guān)。

表皮生長因子(EGF)是一種促有絲分裂因子,在許多細胞類型的生長、增殖和分化中起著重要作用。EGF過表達或基因變異等與腫瘤的發(fā)生和進展有關(guān)[12],EGF通過誘導(dǎo)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型過程和腫瘤干細胞生成來驅(qū)動口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移[13]。還有研究顯示EGF信號通路通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子SOX2促進宮頸癌中腫瘤干細胞的形成[14]。最近的研究也提示其表達的增強與宮頸癌的轉(zhuǎn)移及血管生成有關(guān)[15]。纖維連接蛋白1(FN1)是一種糖蛋白,參與細胞粘附和遷移過程,包括胚胎發(fā)生、傷口愈合、凝血、宿主防御和轉(zhuǎn)移等。FN1通過與ITGA5相互作用抑制直腸癌細胞凋亡,促進腫瘤細胞的存活、侵襲和遷移[16]。有實驗研究表明FN1可促進宮頸癌的增殖和遷移[17-18];且FN1的高水平表達可導(dǎo)致宮頸癌患者的總體生存率下降[19]。整合素(Integrin)是與細胞外基質(zhì)、細胞表面和可溶性配體等結(jié)合的細胞黏附受體家族。本研究共篩選到包括ITGA2B在內(nèi)的6種整合素亞單位基因ITGA4、ITGA7、ITGA11、ITGA2B、ITGB2、ITGB3,且均表現(xiàn)為下調(diào)表達。有研究表明整合素亞基β1的表達水平隨著腫瘤的進展而增加,與腫瘤風險和生存率有關(guān)[20]。藥物實驗研究表明抑制整合素α2/FAK/AKT1/GSK3β信號通路可抑制宮頸腫瘤的生長[21]。宮頸癌細胞SiHa中ITGA2B1調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達[22],而后者與宮頸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基δ磷脂(PIK3CD)是PIK3信號通路的重要催化亞基。抑制PIK3信號通路可以有效抑制宮頸癌細胞增殖和腫瘤生長[24]。血小板衍生生長因子受體β(PDGFRB)在細胞增殖、分化、生長、發(fā)育等調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其表達失控可能引發(fā)癌癥等多種疾病。轉(zhuǎn)錄組芯片分析將PDGFRA確定為宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵節(jié)點基因[25]。抑制PDGFR表達水平可以有效抑制宮頸癌細胞的增殖[26]。最近的一項體外藥物研究表明PDGFR可能作為宮頸癌治療藥物的穩(wěn)定結(jié)合靶點[27]。另外一項研究則將其作為宮頸癌新型生物傳感器檢測方法的生物標記[28]。

細胞周期蛋白D3(CCND3)屬于高度保守的細胞周期蛋白家族,是細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換所必需的。有關(guān)于宮頸癌的研究表明,細胞周期阻滯與G1期轉(zhuǎn)變復(fù)合物Cyclin D3/CDK4/6和Cyclin E/CDK2的消耗有關(guān)[29]。一項關(guān)于實體腫瘤中細胞周期蛋白和相互作用基因通路改變情況的大樣本量統(tǒng)計分析顯示,有5.2%的宮頸腫瘤中發(fā)生了細胞周期蛋白基因改變[30]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合并抑制細胞周期蛋白-CDK2或-CDK4復(fù)合物的活性,是G1細胞周期進程的調(diào)節(jié)因子。CDKN1A啟動子的低甲基化水平會使其表達水平上調(diào),從而抑制顆粒細胞增殖達到改善多囊卵巢綜合征的作用[31]。有研究表明抑制CDKN1A水平會促進宮頸癌細胞增殖和侵襲[32-33]。還有研究認為其在非小細胞肺癌晚期的靶向藥物治療中發(fā)揮應(yīng)答作用,并可作為一種預(yù)測標記[34]。該基因的表達受到腫瘤抑制蛋白p53的嚴格控制,通過CDKN1A介導(dǎo)p53依賴的細胞周期G1期阻滯以響應(yīng)各種應(yīng)激刺激。TP53/CDKN1A通路則在宮頸癌患者化療敏感性中發(fā)揮重要作用[35]。

本研究篩選確定的3個主要信號通路中的7個關(guān)鍵差異基因功能均與腫瘤相關(guān),其中EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB這6個基因的高表達會促進腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移,它們在CXCR2基因敲除細胞中均表現(xiàn)為下調(diào)表達;CDKN1A基因具有抑制腫瘤增殖和侵襲的作用,表現(xiàn)為上調(diào)表達。一項關(guān)于CXCL1-CXCR2軸介導(dǎo)肝母細胞瘤細胞遷移的研究顯示,敲除CXCR2可抑制肝癌的轉(zhuǎn)移潛能[36]。本研究在CXCR2基因敲除HeLa細胞中篩選獲得的7個關(guān)鍵差異基因的變化趨勢也均有利于腫瘤的抑制。本研究結(jié)果進一步說明CXCR2在宮頸癌中發(fā)揮了一定的分子作用,并初步確定與其相關(guān)的HPV感染、宮頸癌發(fā)生發(fā)展的信號通路,以及相關(guān)的功能基因,為后續(xù)研究提供基礎(chǔ),為宮頸癌的進展、預(yù)后及臨床治療提供了一定的分子依據(jù)。