Cockayne綜合征攜帶者行胚胎植入前單基因遺傳學檢測助孕成功1例

曹雅菲，倪亞莉，晏博，陳蕓汐，武苗苗

(1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院,蘭州 730000;2.甘肅省婦幼保健院,蘭州 730050)

Cockayne綜合征(Cockayne syndrome,CS)是一種世界罕見病,屬于常染色體隱性遺傳,1936年由英國兒科醫生Cockayne博士首次提出,其主要特征是生長障礙、智力缺陷、進行性加重的神經和認知功能障礙以及視力和聽力受損,受累兒童可有惡病質及早衰表現[1-2]。據統計,美國CS發病率約2.5/1 000 000[3],西歐約1/2 700 000,日本約為1/2 770 000[4],國內目前尚沒有發病率統計的報道。CS主要是由于DNA損傷后轉錄修復缺陷導致,可使全身多個系統受累[5],是一種進行性加重的多系統遺傳性疾病,通常在嬰兒期或者幼兒期開始發病;在新生兒期,大多數CS患兒發育不會受到影響,但因為漸進式的發育衰竭最終會落后于同齡人[6]。目前認為該疾病是由于ERCC8(CSA)、ERCC6(CSB)、ERCC5(XPG)、ERCC3(XPB)、ERCC2(XPD)這5個基因突變所導致[7-8]。ERCC6(CSB)和ERCC8(CSA)為最主要的致病基因,其中ERCC6基因的突變最常見,約占病例的75%。該基因位于第10(10q11.3)號染色體,可導致CSB型,而ERCC8基因位于第5(5q12.1)號染色體[9],突變可導致CSA型,約占病例的25%[8,10]。迄今為止,關于該病的文獻報道仍只以個案報道為主。本文報道了1對罕見的同時具有ERCC8基因雜合缺失突變的CSA型攜帶者夫婦在生育了1個CSA型患兒后,借助胚胎植入前單基因遺傳學檢測(Preimplantation genetic testing for monogenic disorders,PGT-M)進行阻斷,之后成功妊娠的診療經過。

一、病例資料

患者夫婦,男方30歲,女方27歲,因生育過1個CSA型患兒,想要借助輔助生殖技術生育1個健康的孩子,于2021年12月27日來甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心進行孕前咨詢。男女雙方均為初婚,女方既往孕2產1,2019年藥物流產1次,具體情況不詳;2018年足月順產1男孩(先證者),孩子自幼發育落后,8個月會坐,1歲會爬,1歲半會走,協調性差,只會說單字,理解尚可,面部有紅色皮疹,對光敏感,四肢肌張力低,小下頜,眼窩稍凹陷,雙側招風耳等。因懷疑某種遺傳性疾病,患者夫婦于2021年8月攜男孩在北京大學第一醫院行全外顯子組測序基因拷貝數變異檢測(whole exome sequencing for copy-number variants detection,WES-CNV),結果提示患兒5號染色體5q12.1處純合缺失0.12 kb區域,覆蓋了ERCC8基因的4號外顯子,經家系驗證該變異源于夫婦雙方,與CSA型和紫外線敏感綜合征2型相關,具體結果見表1、圖1。

表1 先證者全外顯子組測序CNV檢測結果

先證者ERCC8基因的Exon4完全缺失(圖中Exon4區域空白,拷貝數為0);男方(父親)1條染色體上ERCC8基因的Exon4未缺失,1條染色體Exon4缺失(圖中Exon4部分缺失,拷貝數為1);女方(母親)1條染色體上ERCC8基因的Exon4未缺失,1條染色體Exon4缺失(圖中Exon4部分缺失,拷貝數接近1)。圖1 家系WES-CNV檢測結果(資料來自外院檢查的結果)

夫妻雙方在接受了相應的遺傳咨詢以及充分獲悉相關情況后簽署了書面的知情同意書,決定選擇PGT-M方案行助孕治療。此方案經我院倫理委員會審批通過[批件號：(2021)GSFY倫審[65]號]。采集夫婦雙方及先證者外周血5 ml,對先證者ERCC8基因的Exon4del突變位點進行家系驗證。圖2為先證者ERCC8基因家系圖譜。

箭頭所示為先證者;Ⅰ-1：父親;Ⅰ-2：母親;Ⅱ-1：先證者;Ⅱ-2：本次PGT-M獲得活產女嬰;WT：野生型;4del：ERCC8基因4號外顯子缺失。圖2 ERCC8基因家系圖譜

參照美國醫學遺傳學和基因組學學會(ACMG)指南的評級標準,該突變被判定為可能致病,并由配偶雙方分別遺傳。同時,對該家系的基因組DNA(gDNA)樣本進行目標基因上游和下游的單核苷酸多態性(SNP)多重擴增,以建立家系SNP單體型,為后續胚胎進行SNP連鎖分析奠定基礎。

女方采用黃體期短效長方案促排卵,成功獲取卵子28枚,采用卵胞漿內單精子注射(ICSI)進行人工授精后有23枚卵子正常受精,形成囊胚21枚,活檢囊胚12枚,對活檢樣本采用單細胞全基因組擴增(Whole genome amplification,WGA),分析胚胎染色體非整倍性。以WGA產物為模板,對ERCC8基因上下游的SNP引物行多重擴增。家系預實驗結果如圖3所示：ERCC8基因(OMIM：609412)存在小片段的缺失,父母雙方均為ERCC8基因雜合缺失變異,先證者分別遺傳自父母的基因突變位點,為純合缺失變異。

男方(父親)和女方(母親)ERCC8-E4拷貝數(黑色柱形)均在0.5附近,提示父母為雜合缺失變異;先證者ERCC8-E4拷貝數為0,提示先證者為純合缺失變異。圖3 家系基因突變位點信息驗證

送檢囊胚滋養層細胞檢測結果示,1枚活檢囊胚未檢出相關數據,1枚攜帶父源突變,4枚攜帶母源突變,4枚為同時攜帶父源和母源突變的胚胎,2枚既不攜帶父源突變也不攜帶母源突變(表2)。經充分遺傳咨詢后對患者行凍融胚胎移植,經內膜準備后將編號P2022014_6囊胚(胚胎評級為5BB)移植到母體,最終成功妊娠。妊娠期通過胎兒頸后透明帶(NT)掃描、B超檢查和羊水穿刺進行胎兒染色體病及單基因病檢查證實與前期PGT-M胚胎的檢測結果完全相同。女方于2023年1月18日成功分娩1名不攜帶父源和母源突變的健康女嬰,出生時體重3 250 g。

表2 12枚囊胚活檢CNV檢測結果

二、討論

CS又稱為科凱恩綜合征、侏儒-視網膜萎縮-耳聾綜合征或小頭、紋狀體小腦鈣化和白質營養不良綜合征[11]?；颊叱３Ｓ猩L遲緩、發育落后,特殊表現有小頭畸形、眼球凹陷、皮膚異常光敏性、可有進行性感音神經性耳聾、進行性視網膜色素變性,還可累積肝臟、腎臟、心血管系統以及內分泌功能[12]。患者大多于20歲之前死亡,且多逝于惡病質引發的呼吸衰竭或者腎臟衰竭[13-14]。

ERCC8基因位于5號染色體的5q12.1區域,由12個外顯子組成,可編碼由396個氨基酸組成的DNA切除修復蛋白,可以作為DNA修復因子參與核苷酸剪接修復過程[15]。該蛋白具有色氨酸-天冬氨酸二肽(WD)-40重復序列,包含7個WD結構域,可形成環狀β螺旋結構,可作為蛋白質相互作用的支架,并且是轉錄偶聯DNA修復所需的E3泛素連接酶復合物的一部分,在紫外線誘導的DNA損傷的核苷酸切除修復轉錄偶聯亞途徑中起重要作用[16]。當ERCC8基因的4號外顯子缺失時會影響ERCC8蛋白的WD-40重復元件,從而導致DNA修復缺陷。缺陷時細胞無法修復基因活躍轉錄鏈損傷,經紫外線照射后細胞RNA合成恢復率下降,患者表現出皮膚光敏性,短時間暴露于陽光,即可發生不同程度曬傷,出現面部紅疹表現?；颊哌€可表現出嚴重的生長發育障礙和神經發育缺陷。目前認為神經發育表型是轉錄失調的結果,可能源于DNA損傷的內源性來源[17],但對于轉錄和核苷酸切除修復障礙仍不能完全解釋有關神經系統退化方面的癥狀。有研究報道,CS的致病機制有：轉錄和轉錄偶聯核苷酸切除修復缺陷、堿基切除DNA修復缺陷和線粒體功能障礙、異染色質丟失、p53泛素化異常、細胞分裂及端粒維持異常等[18-23]。根據疾病起病年齡與嚴重程度,可分為Ⅰ型(經典型)、Ⅱ型(早發型)、Ⅲ型(晚發型)、腦-眼-面-骨(COFS)綜合征、紫外線敏感綜合征(UVSS)。極少數患者同時具有CS和著色性干皮病表型,稱為著色性干皮病-CS型[12]。癥狀從重到輕依次為COFS綜合征、Ⅱ型、Ⅰ型、Ⅲ型和UVSS[24]。

目前臨床上對于CS尚無有效的治療方法,以對癥治療為主,旨在提高患者的生活質量。有研究表明,現在關于CS治療的方向主要有：改善線粒體功能、修復DNA損傷、干細胞治療等,但均處于細胞或動物模型研究階段,所以目前的干預仍然以預防為主[25-29]。CSA型為常染色體隱性遺傳,且所有CS亞型都有此遺傳特點,當配偶雙方都攜帶致病的雜合突變基因時,每次懷孕后代均有25%的可能性為CS患者、50%為無癥狀攜帶者、25%為正常人。因此,提倡CS致病基因攜帶者及CS患者的同胞在生育前積極進行遺傳咨詢,通過基因檢測判斷是否為CS致病基因攜帶者,若為攜帶者,在生育時,需進行夫妻雙方的CS致病基因檢測,若夫妻雙方均為攜帶者就可選擇PGT-M輔助以降低CS患者的出生。對于基因診斷明確的家庭,若已經自然受孕,為明確產前診斷,在妊娠時母親一定要對羊水細胞或者是胎盤絨毛細胞進行基因分析。針對ERCC8基因突變導致的CSA型,其突變類型多數為點突變;ERCC8基因的Exon4缺失在CS患者中少有報道,且夫妻雙方均為Exon4缺失的尚未見報道。

單基因遺傳病,多數可致畸致死且具有家族性和終生性的特點,患者常有嚴重的臨床表現,社會參與性差,對患者家庭及社會造成嚴重負擔。雖然單基因病的發病率低,從幾千分之一到幾千萬分之一,但是種類繁多,是出生缺陷的主要原因之一。PGT-M技術,避免了存在單基因病風險的胚胎植入母體,能更好地實現優生優育,現已廣泛應用于單基因病的孕前阻斷,已經成為預防單基因遺傳病的重要手段之一。本研究中的患者夫婦通過PGT-M技術,對植入母體內的囊胚進行提前遺傳性疾病相關檢測,選擇同時不攜帶父源突變與母源突變的胚胎進行移植,最終獲得活產,即CSA型在該家系已被成功阻斷。對罕見病的罕見基因突變進行生育指導在臨床工作中具有非常重要的意義,本報道旨在通過回顧該對患者夫婦的診療經過為臨床中單基因病患者的治療決策提供一些思路,為PGT-M技術在臨床工作中的應用提供更多數據積累。