不同染色體異常類型患者的囊胚整倍性及妊娠結局

宋雪梅，袁振亞，嚴為巧，李玉雯，朱彤，黃曉潔，袁牧

(徐州市婦幼保健院生殖醫學中心,徐州 221009)

世界范圍內,不孕癥的發生率為8%～12%[1],不孕不育門診除了因常見的女方輸卵管、盆腔因素,男方特發性少弱畸形精子癥、梗阻性無精子癥等原因來就診的患者外,因染色體異常就診的患者也占一定比例。染色體異常包括染色體結構異常和數目異常。染色體結構異常以平衡易位和羅氏易位最為多見,染色體數目異常包括13-三體、18-三體、21-三體及性染色體數目異常等。不孕不育門診染色體數目異?；颊叩呐R床表現以特納綜合征、克氏綜合征、超雄綜合征和超雌綜合征等最為常見[2]。染色體異常在自然流產中占比20%～50%[3],此外,也是新生兒出生缺陷最常見的類型之一[4]。胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)技術通過幫助患染色體畸變的患者在胚胎植入前進行檢測,挑選遺傳學正常的胚胎種植,從而避免遺傳缺陷患兒的出生。由于染色體數目異常和染色體結構異常的致病性差異較大,本研究的目的是探討不同染色體異常類型行PGT檢測后的助孕結局及妊娠結局。

一、對象與方法

1.研究對象：回顧分析2020年1月至2022年11月在我中心行PGT檢測的患者臨床資料。

納入標準：(1)女方年齡≤40 歲;(2)夫妻一方為染色體結構或數目異常攜帶者。排除標準：(1)單基因病;(2)內分泌疾病,如多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥等。

本研究共納入80個染色體異常周期。根據染色體異常類型不同分為2組：染色體結構異常組(n=72)和染色體數目異常組(n=8)。納入本研究的患者均已簽署知情同意書。

2.體外受精及囊胚培養：根據患者自身情況選擇拮抗劑方案或改良長方案促排卵。當≥2個主導卵泡直徑達18～20 mm時,HCG扳機后34～36 h行B超引導下穿刺取卵,將卵丘-卵母細胞復合物放入培養箱中培養4 h后行卵胞漿內單精子注射(ICSI),受精后放入G-TLTM一步式培養液(Vitrolife,瑞典),緊接著放入時差成像培養箱(Embryo Scope+;Vitrolife,瑞典)中培養至D5/D6囊胚階段。

3.囊胚活檢、PGT和胚胎移植：囊胚評分采用Gardner評分系統[5],D5/D6囊胚內細胞團和滋養外胚層細胞評分≥B級的囊胚為優質囊胚,本中心將≥3BC或3CB的囊胚評為可用囊胚。取D5/D6囊胚滋養外胚層3～5個細胞,囊胚隨即行玻璃化冷凍。

PGT主要分為兩步[6]：(1)活檢細胞全基因組擴增后二代測序篩選整倍體胚胎;(2)通過易位斷裂點上下游單核苷酸多態性位點識別第一步獲得的整倍體胚胎的易位攜帶狀態。

基于PGT檢測報告和胚胎評級,將≥3BC或3CB的整倍體囊胚(易位攜帶/易位不攜帶)進行移植,優先移植不攜帶染色體易位的整倍體高評分囊胚。

4.妊娠結局判定及產前診斷：單囊胚移植后4～6周后行B超檢查,若宮內見孕囊及原始心管搏動者判定為臨床妊娠。孕中期(18～22周)行羊水穿刺,對胎兒的染色體核型進行進一步復核確認。

5.觀察指標：比較各組患者的助孕結局和妊娠結局。助孕結局包括2PN率、D3優質胚胎率(D3優胚率)、囊胚形成率、活檢整倍體囊胚易位染色體攜帶率、可用囊胚形成率和囊胚整倍體率;妊娠結局包括臨床妊娠率、流產率和活產率。

2PN率=2PN數/總獲卵數×100%;D3優胚率=D3優質胚胎數/2PN數×100%;囊胚形成率=囊胚形成總數/2PN數×100%;可用囊胚形成率=可用囊胚數/2PN數×100%;囊胚整倍體率=整倍體囊胚數(正常核型或易位核型)/活檢囊胚數×100%;整倍體囊胚易位染色體攜帶率=易位攜帶的整倍體囊胚數/活檢整倍體囊胚數×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%;流產率=流產周期數/移植周期數×100%;活產率=活產分娩周期數/移植周期數×100%。

二、結果

1.染色體結構異常患者的基本情況、助孕結局和妊娠結局：72個染色體結構異常周期根據染色體易位類型不同分為兩個亞組：即平衡易位組(n=52)和羅氏易位組(n=20)。

兩亞組一般情況比較：兩亞組間年齡[(29.40±4.68)歲 vs.(30.60±3.66)歲]、不孕年限[(3.64±2.29)年 vs.(3.20±2.78)年]和子宮內膜厚度[(10.38±1.64) mm vs.(11.21±2.40)mm]比較均無顯著差異(P>0.05)。

兩亞組實驗室指標比較：兩亞組間2PN率、D3優胚率、囊胚形成率和整倍體囊胚易位染色體攜帶率比較均無顯著差異(P>0.05);平衡易位組的可用囊胚形成率顯著低于羅氏易位組(P<0.05),平衡易位組的囊胚整倍體率亦顯著低于羅氏易位組(P<0.01)(表1)。

表1 不同染色體結構異?；颊邔嶒炇抑笜吮容^(%)

兩亞組妊娠結局比較：截至發稿時,共35個因染色體結構異常行PGT的周期進行了胚胎移植,包括平衡易位(n=25)和羅氏易位(n=10)。兩亞組間臨床妊娠率、流產率和活產率比較均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

2.染色體數目異常患者的基本情況和妊娠結局：本研究納入染色體數目異?；颊吖?例患者(8個周期),其中5、6號患者各有2個不同取卵周期。

5例患者(1、2、3、4、5號患者)染色體核型為47,XXY,均有整倍體囊胚移植,截至發稿時3例患者(1、3、4號患者)各分娩1名健康新生兒,5號患者仍在妊娠隨訪中;6號患者染色體核型為47,XYY,t(12;18)(p11.2;p11.3),共活檢10枚囊胚,其中4枚為整倍體囊胚(3枚正常核型、1枚攜帶易位染色體核型),移植1枚正常核型整倍體囊胚后活產1女嬰(表3)。

表2 不同染色體結構異?；颊呷焉锝Y局比較(%)

表3 染色體數目異常患者的基本情況和妊娠結局

三、討論

染色體異?；颊咴谟g期往往會遇到不育或自然流產的問題,與正常核型夫婦相比會產生更多不平衡配子,PGT是改善染色體異?；颊呱Y局的有效手段[7]。自1990年Handyside等[8]首次通過PCR技術為攜帶X連鎖隱性遺傳病患者篩選女性胚胎并獲得健康新生兒以來,PGT技術被廣泛應用于臨床。近年來隨著分子遺傳學檢測技術的進步和人類基因組計劃的完成,以二代測序為代表的PGT技術通過對胚胎染色體數目異常、結構異常和有病理意義染色體微小片段插入、缺失與重復進行檢測,挑選遺傳學正常的胚胎植入子宮,從源頭上切斷遺傳性缺陷的胚胎種植[9]。

平衡易位約占新生兒出生比例的0.2%,是不孕不育夫婦中最常見的染色體結構異常類型,在配偶染色體結構正常的情況下理論上平衡易位患者受精可形成18種類型的配子,其中1/18為完全正常配子、1/18為易位攜帶的配子、16/18為異常配子[2]。羅氏易位可分為同源易位和非同源易位,其中同源易位攜帶者受精后可形成2種異常類型的配子,非同源易位攜帶者理論上可形成6種類型的配子,其中1/6為完全正常的配子、1/6為易位攜帶的配子、4/6為異常配子[2]。本研究結果顯示,平衡易位和羅氏易位患者形成的囊胚整倍體率遠高于理論值,推測可能的原因是由于有一部分異常配子在囊胚形成過程中被自然淘汰所導致的。

Beyer等[10]研究發現,無論是相互易位還是羅氏易位攜帶者,其形成的D3卵裂期胚胎的正常/平衡胚胎的比例顯著低于D5/D6囊胚期胚胎,說明選擇囊胚期胚胎進行活檢除了可以減少對囊胚內細胞團細胞發育的影響外,還可以將發育潛能差的異常配子剔除。龐敏等[11]研究發現,相互易位和羅氏易位患者的囊胚整倍體率分別為29.2%和46.9%,但組間比較無顯著差異(P>0.05);Boynukalin等[12]研究發現,染色體易位的長短、斷點位置與囊胚整倍體率無關(P>0.05)。孫慶云等[13]和Nakano等[14]研究結果顯示,平衡易位患者囊胚整倍體率與羅氏易位患者相比顯著降低(P<0.05),分析原因可能與不同染色體結構異常類型所產生的正常配子比例不同有關。本研究也得出了相同的結果。

染色體易位攜帶者雖然表型正常,但往往在生育期會面臨不孕不育、胚胎發育阻滯和反復自然流產等問題,研究人員利用等位基因映射識別技術可以準確識別胚胎染色體易位攜帶狀態,通過PGT技術使其下一代成功擺脫因染色體易位引起的不良生育風險[6,15-17],阻斷染色體易位在家族傳遞。本研究結果顯示,平衡易位和羅氏易位患者行PGT后再行單囊胚移植,兩組間臨床妊娠率、流產率和活產率比較均無顯著差異(P>0.05),這與Nakano等[14]和黃秋香等[15]的研究結果一致。Yuan等[16]研究發現,對羅氏易位和平衡易位夫婦而言利用PGT技術排除胚胎染色體異常的因素后,其流產率得以極大改善。此外,有研究以自然懷孕后流產≥3次的染色體平衡易位/羅氏易位的患者為研究對象(192例),PGT后解凍周期胚胎移植組相較于自然妊娠組,流產率顯著降低和累積妊娠率顯著升高(P<0.05)[18]。

克氏綜合征是男性不育中常見的染色體數目異常類型,以47,XXY核型最為常見,占出生男孩0.1%,通常在孩童期無特殊表現,青春期表現為小睪丸,睪丸發育不良導致男性表現為無精子癥或嚴重少精子癥[2]。大部分47,XYY綜合征患者可正常生育,部分患者睪丸發育不良導致無精子癥[19-20]。2018年,胚胎植入前遺傳學診斷/篩查技術專家共識[21]認為,47,XXY因其生育子代染色體異常風險增加可酌情考慮行植入前遺傳學診斷(PGD),而47,XYY產生性染色體異常幾率較低則不建議行PGD。本研究中5名47,XXY患者的6個PGT周期未涉及性染色體異常的胚胎,這與先前的研究結果[22-23]一致。此外,童婧等[24]研究發現,非嵌合型克氏綜合征患者的囊胚整倍體率為60.0%,所有活檢的胚胎均未涉及到性染色體異常。本研究還報道了染色體核型為47,XYY,t(12;18)(p11.2;p11.3)的患者的2個拮抗劑促排卵周期,共獲4枚整倍體囊胚,其中3枚正常核型、1枚攜帶易位染色體(父親)核型,說明雖然文獻報道超雄患者性染色體異常風險不高[22],但臨床上仍存在一定比例的性染色體異常風險。

綜上所述,羅氏易位和平衡易位夫婦利用PGT技術有效阻斷遺傳性缺陷的胚胎種植后,妊娠結局得以極大改善,同時切斷了染色體易位在家族下一代傳遞。47,XXY患者理論上在減數分裂產生配子的過程中會導致性染色體異常風險增加,但本研究中尚未檢出涉及性染色體異常的胚胎。由于樣本量少,47,XXY對子代染色體異常風險的影響仍需要臨床多中心大樣本隨訪數據的支持。