基于干種子DNA的洋蔥雜交種純度分子標記快速鑒定

孫亞玲 李艷偉 王振寶 吳雄 劉冰江 楊妍妍

關鍵詞：洋蔥；種子；DNA提取；純度；快速鑒定

洋蔥（Allium cepaL．）屬于石蒜科（Amarylli-daceae）蔥屬（Allium）二年生草本植物，栽培歷史悠久，適應性強，在我國種植范圍較廣。隨著分子生物學的快速發展，采用分子標記技術與傳統育種相結合的方法開展洋蔥分子育種研究已成為趨勢。DNA提取是分子技術實施的基礎環節，DNA制備質量對于后續實驗開展的效率及準確率尤為重要。傳統的植物總DNA提取方法有CTAB法、SDS法和高鹽低pH法等，國內外生物公司還開發了多種商品化快捷型的DNA提取試劑盒。但由于不同植物中次生代謝產物的種類和含量存在較大差異，即使同種植物不同組織的次生代謝產物和含量也不盡相同，使得對某種植物組織優化的DNA提取方法不一定適用于其他材料。

目前已成功從植物葉、莖、根、幼苗、組培苗、愈傷組織、果實等組織或器官中提取到DNA，而干燥種子的DNA與組蛋白緊密結合，導致提取的DNA豐度低、質量不高，加大了從含有大量蛋白質、多糖類物質的干種子中提取高質量DNA的難度。關于從種子中提取DNA的實驗方法國內外已有報道，如：Chunwongse等發明了從水稻和小麥的半粒種子中提取DNA的方法：McDo-nald、Kang等發明了從玉米、棉花、小麥、花生、大豆等作物種子中提取DNA的方法：國內研究者也相繼發明了從不同作物干種子中提取DNA的方法，并取得了較好的效果。但關于洋蔥干種子DNA提取方法尚未見報道。鑒于此，本研究以洋蔥干種子為試材，考慮到種子中含有蛋白質、脂肪和多糖等，采用全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統、TPS法和CTAB法提取洋蔥干種子及不同發芽天數種子的基因組總DNA。同時對種子用量進行篩選，通過比較提取的DNA質量，確定了一種能夠從洋蔥干種子中提取高質量DNA的方法，并用于對雜交種Ms位點基因型的SCAR標記鑒定，以期建立一種基于干種子DNA的洋蔥雜交種純度鑒定體系，為快速準確地鑒定雜交種的純度及進行種質資源的遺傳多樣性分析等工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究選用黃皮洋蔥雜交種‘天正105、紫皮洋蔥雜交種‘紫鈴及其父母本的種子，均由山東省農業科學院蔬菜研究所洋蔥課題組提供。

1.2DNA提取方法

1.2.1PlantZol試劑盒法參照北京全式金生物技術有限公司PlantZol（EE141 -01）試劑盒說明書對3粒‘紫鈴干種子進行DNA提取。

1.2.2快捷型植物基因組DNA提取系統法參照天根生化科技（北京）有限公司快捷型植物基因組DNA提取系統（DP321非離心柱型）說明書對3粒‘紫鈴干種子進行DNA提取。

1.2.3TPS法將3粒‘紫鈴干種子放人2.0mL離心管中，加入鋼珠，在組織破碎儀中破碎2min；加人800uL TPS緩沖液禾口5uL RNase，渦旋振蕩1min，80℃水浴加熱30min，期間顛倒混勻2～3次；12000r/min離心5min，取上清液至新的1.5mL無菌離心管中，加入等體積的異丙醇，再12000r/min離心5min，沉淀用70%乙醇洗2次，徹底晾干；加入20uL無菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃凍存備用。

1.2.4CTAB法分別將1、2、3、4、5粒‘紫鈴干種子及其發芽3、5、7、9d的種子放人2.0 mL離心管中，加入鋼珠，在組織破碎儀中破碎2min;加入1mL65℃預熱的CTAB提取液和5uLRNase，渦旋振蕩1min，65℃恒溫水浴30min，期間顛倒混勻2～3次，12000r/min離心5min，吸取上清液至新的2.0mL無菌離心管中，用DNA提取液（25：24：1）抽提1次，12000r/min離心5min，吸取上清液至新的1.5mL無菌離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，12000r/min離心5min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，徹底晾干：加入20uL無菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃凍存備用。

1.3基因組總DNA的質量檢測

基因組總DNA的質量主要用DNA的完整性、純度和濃度來衡量。分別采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳、Nano Photometer超微量分光光度計儀（IMPLEN，P-Class P330）對提取的總DNA進行質量檢測。

1.4基于SCAR標記的洋蔥雜交種純度鑒定

利用本課題組開發的洋蔥細胞核雄性不育分子標記SCAR（ sequence characterized amplified re-gions．特定序列擴增）進行PCR擴增，用于洋蔥雜交種的純度鑒定。所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35個循環；72℃后延伸10min，4℃保存。反應結束后，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1洋蔥干種子基因組總DNA提取方法的比較分析

采用全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統、TPS法和CTAB法分別提取洋蔥干種子的基因組總DNA，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果（圖1）顯示，除天根快捷型植物基因組DNA提取系統未出現相應的DNA電泳條帶外，其他3種方法均可得到完整的DNA條帶。但全式金PlantZol試劑盒和TPS法提取的基因組總DNA帶型呈鋸齒狀，在點樣孔處有明顯的殘留物質，其中TPS法的點樣孔處殘留物質尤其多；CTAB法提取的基因組總DNA帶型整齊一致、單一明亮，條帶無拖尾和降解現象，也沒有明顯的RNA和蛋白污染。

采用超微量分光光度計對所提取DNA的完整性和純度進行檢測，每種提取方法獲得的DNA樣本均進行3次重復。結果（表2）顯示，CTAB法提取的DNA濃度和純度均最好，天根快捷型植物基因組DNA提取系統提取的DNA濃度和純度最差，這與瓊脂糖凝膠電泳結果一致。

綜上所述，CTAB法是提取洋蔥干種子DNA的最佳方法，用該方法進行后續試驗。

2.2不同粒數洋蔥干種子基因組總DNA提取質量的比較

分別選取1、2、3、4、5粒洋蔥干種子，采用CTAB法進行基因組總DNA的提取。對提取DNA的質量檢測（圖2和表3）發現，不同粒數洋蔥干種子均能獲得完整的基因組DNA，且DNA濃度隨著種子粒數的增加逐漸升高。用1粒和2粒洋蔥干種子提取的基因組DNA條帶雖然較弱，但帶型整齊，無拖尾現象，點樣孔處無明顯的殘留物質，OD260/OD280分別為1.807和1.809；用3、4、5粒種子得到的DNA條帶雖然明亮，但帶型不整齊，呈鋸齒狀，點樣孔處也越來越亮，OD260/OD280分別為1.701、1.652、1.528，說明存在多糖和蛋白等雜質污染。總體來說，基因組DNA的濃度與種子數量呈正相關，而DNA質量以1～2粒種子的較好。

2.3洋蔥干種子及不同發芽天數種子基因組總DNA提取質量的比較

分別選取干種子及發芽3、5、7、9d的洋蔥種子，采用CTAB法進行基因組總DNA的提取。對提取DNA的質量檢測結果（圖3和表4）表明，洋蔥干種子及不同發芽天數的種子均能提取到帶型整齊、無彌散現象的基因組DNA。發芽種子的DNA濃度均明顯高于干種子，且隨著發芽天數的增加，DNA濃度越來越高，分別是干種子的1.53～4.01倍，發芽第9天種子的DNA濃度達到262.1ng/uL。但是發芽第5、7、9天的種子提取的DNA點樣孔處有輕微的蛋白殘留，而干種子和發芽第3天的種子提取的DNA條帶單一清晰，點樣孔處干凈無雜質，OD260/OD280分別為1.836和1.837，說明洋蔥干種子和發芽第3天的種子提取的基因組總DNA更加完整，純度更高。

2.4基于SCAR標記的洋蔥雜交種純度鑒定

經過上述試驗，最終確定CTAB法提取1粒洋蔥干種子DNA的效果最好，用該方法進行洋蔥雜交種純度鑒定。以洋蔥雜交種干種子的DNA為模板，利用SCAR分子標記進行DNA提取質量的檢測，同時對Ms位點基因型做出判斷。結果（圖4）顯示擴增出898 bp和621 bp兩條清晰明亮的條帶，說明檢測種子的Ms位點基因型為雜合的Msms，是真實的雜交種。表明用CTAB法從1粒洋蔥干種子中提取的DNA完全可以滿足雜交種分子標記鑒定的要求。

利用SCAR分子標記對本課題組選育的洋蔥雜交種純度進行鑒定。隨機選擇當年收獲的洋蔥雜交種‘天正105和‘紫鈴的種子各150粒，采用CTAB法提取DNA，分別以兩個雜交種的父、母本作對照進行PCR擴增。結果顯示所檢測的洋蔥種子DNA均同時具有父、母本的特異性條帶（圖5），說明檢測的種子是真正的雜交種，品種純度為100%。可見，用本研究確定的方法提取的洋蔥干種子DNA質量好，用其基于SCAR分子標記檢測洋蔥細胞質基因型，能實現雜交種純度的早期鑒定。

3討論與結論

關于植物種子DNA最優提取方法的篩選，前人研究多以甜瓜、玉米、大豆、小麥等作物為主，對于蔥屬植物基因組DNA提取方法的研究較少。本研究對全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統、TPS法和CTAB法4種方法提取的洋蔥種子DNA質量進行了比較，對不同發芽天數種子及得到有效DNA的種子用量進行了優化篩選，經過凝膠電泳分析和分光光度計檢測，結果表明CTAB法提取的洋蔥干種子基因組總DNA質量最好，這與水稻、小麥、玉米等作物種子基因組總DNA提取效果的研究一致。同時，我們通過研究不同粒數（1～5粒）洋蔥干種子DNA提取效果，發現種子粒數越多，相應的雜質也越多，這可能是由于提取時混有大量種皮且洋蔥富含多糖多酚的緣故。

隨著分子生物學技術的發展，基于DNA多態性的分子標記正逐漸成為作物雜交種純度鑒定的有力工具。通過分子標記鑒定雜交種純度，可以大大縮短鑒定周期，且操作簡單，是一種更直接且準確高效的方法。洋蔥DNA的有效提取是分子標記鑒定雜交種純度的前提和基礎，也是較為關鍵的步驟。目前，關于植物基因組DNA提取方法已有大量報道，但大多是以葉片作為DNA的提取材料，需要在播種后25～30d的苗期才能進行DNA提取操作，所需周期較長。本研究利用干種子作為提取材料，不經過苗期階段，在獲得雜交種種子后采用1粒洋蔥干種子即可獲得有效DNA，并利用SCAR分子標記對雜交種純度進行鑒定，不但降低了種子消耗成本，還實現了雜交種純度的早期鑒定。

洋蔥雜交種生產主要是利用“三系”法，即細胞質雄性不育系、保持系和父本自交系配套的雜交制種技術。一般情況下，親本純合性越高，雜交種的優勢越強。利用基因型為S（msms）的不育系為母本，與基因型為N/S（MsMs）的父本自交系雜交生產雜交種子，雜交種的基因型通常為S（Msms）。洋蔥雜交種商品化生產過程中，父本拔除不徹底、隔離措施不當或者機械混雜等均有可能導致雜交種純度降低。而雜交種的遺傳真實性是種子質量的重要標志之一，種子純度是衡量種子質量優劣的核心指標，直接影響洋蔥的產量、商品性和品質。因此，隨著洋蔥雜交種的廣泛應用和種業市場的日趨成熟，種子純度快速檢驗的重要性越來越突出。目前，AFLP、SSR、SRAP、In-Del、SNP等分子標記技術已被廣泛應用于瓠瓜、茄子、大白菜、甜瓜、黃瓜及辣椒等蔬菜的雜交種純度鑒定中。本研究利用SCAR分子標記對雜交種Ms位點的基因型做出判斷，進行洋蔥雜交種的純度鑒定。采用CTAB法從1粒洋蔥干種子中提取的DNA可以擴增出清晰明亮的條帶，根據條帶的遷移位置可以清楚區分洋蔥不同細胞核基因型之間的差異。PCR擴增結果顯示所檢測的洋蔥種子DNA均能擴增出898 bp和621bp兩個片段，說明檢測種子Ms位點的基因型為雜合的Msms，是真實的雜交種。

本研究確定了CTAB法為洋蔥干種子基因組總DNA提取的最佳方法，以1粒洋蔥干種子獲得的有效DNA完全可以滿足雜交種分子標記鑒定的要求，且利用SCAR分子標記技術鑒定洋蔥雜交種的純度，大大提高了檢測效率，具有廣泛的應用前景和利用價值。