番茄環紋斑點病毒核衣殼蛋白N的RT-LAMP檢測方法的建立

羅海燕 李恒 陸承聰 魏輝 鄭雪 陳勇

關鍵詞：番茄環紋斑點病毒；核衣殼蛋白N;逆轉錄環介導等溫擴增技術；檢測

植物病毒病素有“植物癌癥”之稱，是導致作物減產和品質下降的主要因素之一，全球每年因植物病毒病害造成的經濟損失高達300億美元。在已報道的1484種植物病毒病害中，70%以上由媒介昆蟲傳播。番茄環紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）屬正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），于2005年在我國云南省被首次發現并報道，自然狀態下主要侵染番茄（So-lanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、煙草（Nicotiana tabacum）和馬鈴薯（Solanum tuberos-Mm）等20多種作物及雜草，主要由西花薊馬（Franilclinella occz，dentalis）、梳缺花薊馬（F．shcu-letzi）、棕櫚薊馬（Thrips palmi）等薊馬類昆蟲以持久增殖型方式傳播，也可通過機械摩擦傳播。近年來，除云南外，在北京、貴州及廣西的辣椒、番茄產區也檢測到該病毒病發生，危害有蔓延至周邊省份的趨勢。建立一種高效、特異、靈敏的檢測方法對TZSV的預警及發病規律研究具有重要意義。

逆轉尋環介導等溫擴增技術（reverse tran-scription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是將環介導等溫擴增與逆轉錄反應相結合直接檢測RNA的方法，當被檢RNA與反應混合物中的pH指示劑耦合時，可通過顏色變化獲得檢測結果。RT-LAMP技術已被廣泛應用于糧食、果樹、蔬菜等農作物病毒病的檢測。李戰彪等建立了基于TZSV RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRp）的RT-LAMP技術。但迄今國內外未見有利用該技術檢測TZSV核衣殼蛋白N（nucleocapsid protein N）的報道。本研究根據TZSV核衣殼蛋白N的基因序列設計RT-LAMP引物，建立快速高效、特異靈敏的TZSV RT-LAMP檢測體系，以期為TZSV的鑒定及防控提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試病葉及病毒感染TZSV、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosazicVLrUS，TMV）的辣椒葉片均由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所提供，經RT-PCR檢測確定病毒種類后，-80℃保存備用。攜帶TZSV-Ⅳ基因的質粒pTOPO-TZSV-N由福建省農業科學院植物保護研究所生物安全實驗室構建并保存。

1.1.2主要試劑TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、EasyScript Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒、Trans2k Plus DNA Marker、dNTPs均購自北京全式金生物技術有限公司：Bst DNA聚合酶、10xBst Reaction Buffer購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR Green I和甜菜堿購自北京索萊寶科技有限公司；Bst聚合酶、Mg-S04購自New England Biolabs（美國）；其他試劑均為常規分析純試劑。

1.1.3主要儀器Bio-rad TlOO PCR儀、MINI-PRATEA電泳儀、Bio Rad SYSTEM GelDocXR+凝膠成像系統均購自美國Bio -rad公司。

1.2試驗設計與方法

1.2.1引物設計根據GenBank中TZSV-N基因序列（登錄號：MG656995.1），利用Primer Ex-plorer V4軟件設計RT-LAMP獷增引物，其中F3和B3為外引物、FIP和BIP為內引物（表1），由福州尚亞生物技術有限公司合成。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成按照TransZolPlant試劑盒操作說明提取病葉總RNA（終濃度1ug/uL），-80℃保存備用。以RNA為模板，利用EasyScript Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA，-20℃保存備用。

1.2.3RT-LAMP和RT-PCR反應體系

25uLRT-LAMP反應體系：8U/uL Bst 2.0 DNA聚合酶反應條件：60℃1h，80℃5min。反應結束后，加入2.0uL SYBRGreen I核酸染料，觀察顏色反應；或取5uL擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀觀察、拍照。

1.2.4特異性及靈敏度檢測分別以感染TZSV、TSWV、TMV的辣椒葉片總RAN為模版，利用建立的反應體系進行RT-LAMP擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與RT-PCR擴增結果對比，明確該方法的特異性。

將感染TZSV的總RNA用RNase-free H2010倍梯度稀釋（1.0x10-1～1.0x10-9），以稀釋后的RNA為模板，分別進行RT-LAMP和RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，比較兩者的靈敏度。

1.3RT-LAMP方法的應用

秋冬季從云南省采集疑似感染TZSV的辣椒葉片，提取總RNA，利用本試驗建立的RT-LAMP和普通RT-PCR體系擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。RT-LAMP反應產物中加入2.0uLSYBR Green I核酸染料，陽性為綠色，陰性為橙色。

2結果與分析

2.1RT-LAMP引物篩選

以質粒pTOPO-TZSV-N為模板，進行RT-LAMP反應，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，引物組I產生典型的LAMP梯狀條帶，擴增效果最好，其余兩組無明顯的梯狀條帶（圖1A）；終止反應后向反應液中加入SYBR Green I，可見引物組I變為綠色，其余兩組為橙色（圖1B）。因此，選擇第1組引物進行特異性和靈敏度檢測。

2.2RT-LAMP的特異性檢測

以TZSV陽性樣本為陽性對照，健康植物樣本為陰性對照，對TMV和TSWV陽性樣本進行RT-LAMP檢測。結果顯示，只有TZSV陽性樣品出現梯狀條帶，其它病毒和健康植物樣本中未產生梯狀條帶，與RT-PCR檢測結果相同（圖2），說明建立的TZSV

RT-LAMP檢測方法具有較強的特異性。

2.3RT-LAMP的靈敏度檢測

將1ug/uL的TZSV總RNA進行10倍梯度稀釋，以不同濃度RNA為模板分別進行RT-LAMP和RT-PCR擴增。結果顯示，RNA濃度被稀釋至0.01pg/uL（10-8）時，RT-LAMP方法仍能檢測出TZSV（圖3A），而RT-PCR只能檢測到RNA濃度稀釋至0.1pg/uL（10-7）的樣品（圖3B），表明RT-LAMP檢測方法的靈敏度是RT-PCR的10倍。

2.4RT-LAMP技術的田間檢測應用

對采自云南省的疑似感染TZSV的辣椒葉片進行RT-LAMP和RT-PCR檢測。結果顯示，6份樣品中利用RT-LAMP方法檢測出4份TZSV陽性樣品，與RT-PCR檢測結果一致。向RT-LAMP反應產物中加入SYBR Green I核酸熒光染料，陽性樣品迅速變為綠色，陰性樣品為橙色，結果一致（圖4）。綜上，本研究建立的RT-LAMP檢測法可用于田間辣椒TZSV快速檢測。

3討論與結論

關于TZSV的檢測，目前已建立了血清學、電鏡觀察、分子生物學等技術。與血清學、電鏡觀察等手段相比，RT-PCR和RT-qPCR等分子生物學方法靈敏度較高、特異性較強，是TZSV檢測最常用的方法，但在日常病害診斷中耗時長、操作繁瑣且受限于高精度的實驗儀器。本研究根據TZSV的核衣殼蛋白Ⅳ基因設計引物，建立了TZSV的RT-LAMP檢測技術，具有操作簡便、特異性和靈敏度高、反應時間短、無需貴重儀器等優點，擴增產物既可凝膠電泳檢測，也可依據顏色變化可視化判定，為生產及科研單位快速診斷TZSV提供了技術支持。

特異性是檢測RT-LAMP技術最為重要的指標之一。TZSV是茄科作物上的重要病原菌，與正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）代表種TSWV同為云南地區蔬菜上的優勢病毒，常交替或同時發生。李戰彪等報道了基于TZSV-RdRp的RT-LAMP檢測方法，但未明確其是否能特異性區分TZSV與TSWV。本研究以TZSV-N為靶標基因設計篩選了其RT-LAMP特異性引物，有效擴增到TZSV，未擴增到TSWV，表現出較高的特異性。

通常，RT-LAMP檢測的靈敏度要高于普通RT-PCR。本研究建立的TZSV RT-LAMP方法RNA濃度檢測下限為0.01 pg/uLL，是RT-PCR靈敏度的10倍，也略高于基于TZSV-RdRp的RT-LAMP方法。此外，由于TZSV侵染引起的病癥存在低溫隱癥現象，給病害的診斷造成一定困難。本研究對秋冬季采自云南的6份辣椒葉片疑似病樣進行鑒定，檢測結果與RT-PCR一致，表明建立的RT-LAMP檢測技術對隱癥或病毒含量較低的樣品也可有效檢測。

綜上，本研究建立的TZSV-N基因的RT-LAMP檢測方法能夠特異擴增TZSV，靈敏度為RT-PCR的10倍。在RT-LAMP反應產物中加入SYBR Green I核酸熒光染料用肉眼觀察即可判斷樣品是否感染TZSV．該結論可為TZSV的鑒定及防控提供技術支持。