基于NLRP3信號通路探討三痹湯對佐劑型關節炎大鼠的治療作用及機制探討

姚舒婷，張春芳，周晶

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廈門大學附屬翔安醫院，福建 廈門 361000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性的炎癥性關節炎，其特征是進行性軟骨和骨質破壞以及自身抗體的產生，以滑膜增生、關節軟骨破壞及關節畸形為主要病理改變［1］。RA患者活動受限，甚至導致殘疾，需要承受巨大的經濟和心理壓力。RA全球患病率約為1%，我國患病率約為0.28%～0.40%，其中患病男女比例為1∶3，尤其是45～54歲的女性尤為高發［2］。研究表明，RA的發病與多種因素密切相關，當疾病發生后，自身免疫系統啟動，分泌大量的炎性因子，從而引發“炎性風暴”，造成骨破壞，若病情得不到控制，最終導致患者關節畸形或功能喪失［3］。西醫主要依靠藥物治療，一經確診就需終身服藥，且部分患者由于不良反應、過敏等，難以堅持用藥［4］。三痹湯首載于《婦人大全良方》，具有祛風濕、強筋骨、補肝腎的功效，常用于痹癥的治療［5］。藥理學研究發現，在抗炎止痛、保護骨組織、提高免疫力等方面，三痹湯所含有效成分具有良好的效果［6］。課題組前期研究表明，三痹湯能夠有效降低血清中TNF-α、IL-8、IL-17、IL-1、IL-6和MCP-1的含量，抑制MMP-3、明膠酶-B表達水平，調控TLR4/MAPKs/NF-κB信號通路，并可提高IL-10、TGF-β的表達，抑制炎癥反應，改善骨質破壞［7］。NLRP3炎性體（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）在RA的發生中起關鍵作用，NLRP3炎性體蛋白的突變可引起RA患者NLRP3炎性體的活性增強，在RA患者細胞和滑膜中可觀察到NLRP3 mRNA和NLRP3-炎性體相關蛋白和基因的高水平表達，通過激活Caspase-1，從而使IL-1β和IL-18表達升高，引起骨破壞及關節組織損傷［8］。為了進一步觀察三痹湯治療類風濕關節炎的作用機制，本研究通過復制佐劑型關節炎大鼠模型，以NLRP3信號通路為切入點，探討三痹湯對佐劑型關節炎（adjuvant arthritis，AA）模型大鼠滑膜損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質量（160±200） g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司。許可證號：SCXK（遼）F20220531051，相對濕度為40%～70%，大鼠在正常室溫下于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院動物房適應性喂養一周，飲水、飲食、活動自由，所有操作均符合動物倫理學要求。

1.2 藥物與試劑

三痹湯組方：川續斷30 g，杜仲30 g，防風30 g，肉桂30 g，細辛30 g，人參30 g，白茯苓30 g，當歸30 g，白芍30 g，黃芪30 g，川牛膝30 g，甘草30 g，秦艽5 g，生地黃5 g，川芎5 g，川獨活15 g，均購于黑龍江省藥材公司。

三痹湯藥液的制備：三痹湯遵循原方比例，將方中所有生藥加3倍水浸泡1 h，大火煮沸后小火煎煮1 h，紗布過濾，收集藥液。再加2倍水煮沸后煎煮1 h，收集藥液。將兩次藥液混合在一起，濃縮至3.52 g/mL，加蒸餾水配制成三痹湯混懸液，濃度為20%，冷藏儲存備用。

來氟米特混懸液的制備：將來氟米特片（福建匯天生物藥業有限公司，批號：20061229）研磨成粉，用純水配成1.8 mg/kg的來氟米特混懸液，冷藏儲存備用。

試劑：注射用完全弗式佐劑（美國Sigma公司，貨號：F5881）；IL-1β、IL-18試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G3013）；4%多聚甲醛（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0010）；PBS溶液（0.01M）（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0002）；10×EDTA修復液（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0015）；蘇木素染液（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B1001）；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號：10006818）；Anti-NLRP3 antibody（武漢菲恩生物科技有限公司，批號：20221110）；Anti-Caspase-1 antibody（武漢菲恩生物科技有限公司，批號：20221110）；異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：80109218）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：10009218）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（吉諾生物醫藥技術，批號：GNM14002）；SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio，批號：G3330）；HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix （No Rox Plus） 11201ES（Shanghai Yeasen BioTechnologies，批號：11201ES03）。

1.3 實驗儀器

足容積測量儀（自制）；勻漿儀（Servicebio，型號：KZ-Ⅲ-FP）；臺式高速冷凍型微量離心機（DragonLab，型號：D3024R）；超凈工作臺（蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1FD）；超微量分光光度計（Thermo，型號：NanoDrop2000）；標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司，型號：FBZ2001-up-p）；離心管（Biosharp）；TIP頭（Biosharp）；酶標分析儀（Rayto RT-6100）；熒光定量PCR儀（酷搏科技，Quantagene q225熒光定量PCR檢測系統）；普通光學顯微鏡（OLYMPUS，型號：CX-21）；倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號：Ⅸ51）；成像系統（Q-IMAGING，型號：MicroPublisher）；離心管、TIP頭均購濕熱滅菌40 min，干燥。

2 方法

2.1 動物分組及造模

60只大鼠，適應性喂養1周，隨機選取10只作為空白組（Control），剩余50只大鼠制備佐劑型誘導關節炎大鼠模型。常規消毒后將其右后肢拉直，用1 mL 注射器針頭于足跖中部皮內注射，每只大鼠注射0.1 mL弗氏完全佐劑，每日觀察大鼠右后肢發炎腫脹情況和其他體征表現，若右后肢出現明顯的發炎紅腫和活動受限情況，且AI評分 ≥ 6分表明大鼠佐劑性關節炎模型誘導成功。造模后第7天所有AA大鼠AI評分 ≥6分，提示模型誘導成功。將造模成功的50只大鼠隨機分為模型組（Model）、來氟米特組（LeF）和三痹湯高劑量組（SBT-H）、三痹湯中劑量組（SBT-M）、三痹湯低劑量組（SBT-L），每組10只。

2.2 給藥方法

造模后第8天開始給藥，連續給藥3周，按大鼠與人的體表面積計算出相應的用藥劑量，三痹湯高劑量組灌服三痹湯7.35 g/kg；三痹湯中劑量組灌服三痹湯3.67 g/kg；三痹湯低劑量組灌服三痹湯1.83 g/kg，來氟米特組灌服來氟米特混懸液1.8 mg/kg；模型組和空白組灌服相同體積的蒸餾水，連續灌胃21 d，每日1次，至免疫后28 d處死大鼠。

2.3 觀察指標

2.3.1 關節腫脹程度

在免疫前及免疫后，每周用自制足容積測量儀測量各組大鼠右后足容積，以足容積變化情況觀察足腫脹程度。

2.3.2 關節炎指數

在造模前，后續每隔7 d各組大鼠關節腫脹度并對其進行關節炎指數評分（AI），根據大鼠四肢紅腫程度評為1～4分。0分，無腫脹；1分，單一趾關節紅斑或輕微腫脹；2分，兩個及兩個以上趾關節出現中度紅腫現象；3分，整個足爪包括趾跖關節在內都嚴重發炎紅腫；4分，整個踝關節嚴重腫脹甚至變形。大鼠四肢關節所得的評分相加，即為關節炎指數，AI ＞ 6分即可認為大鼠炎癥明顯，造模成功。

2.3.3 滑膜組織標本采集及HE病理學觀察

取大鼠踝關節滑膜組織，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。進行組織切片（2～4 μm），HE常規染色。組織切片進行脫蠟，采用體積分數100%、90%、75%乙醇梯度脫水，滴加蘇木素染色5 min，沖洗3 s，滴加1%鹽酸乙醇分化，沖洗，滴加0.5%伊紅染色液3 min，沖洗，采用體積分數75%、90%、100%乙醇脫水，滴加松節油透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察踝關節滑膜組織形態學病理改變。

2.3.4 血液樣本采集及血清炎性指標檢測

末次給藥后禁食24 h，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA檢測試劑盒測定血清IL-1β、IL-18。檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.3.5 PCR法檢測各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA表達水平

2.3.5.1 總RNA抽提

①取勻漿管，置冰上預冷，加入1 mL的Trizol Reagent，研磨中至無可見沉淀。②12 000 r/min離心10 min取上清。③加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管30 s，充分混勻，靜置5 min。④4 ℃ 下12 000 r/min離心15 min。⑤將上清轉移到新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。⑥-20 ℃放置20 min。⑦4 ℃下12 000 r/min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。⑧重復洗滌一次。⑨加入10 μL無RNA酶的水溶解RNA。⑩55 ℃孵育5 min。

2.3.5.2 反轉錄

反轉錄體系：5×Reaction Buffer 4 μL；Oligo（dT）18Primer（50 μm）1 μL；Servicebio?RT Enzyme Mix 1 μL；RNase free water 12 μL；mRNA 2 μL。

2.3.5.3 逆轉錄程序設置

輕輕混勻并離心，于PCR儀上進行，程序設置見表1。

表1 PCR儀程序設置

2.3.5.4 定量PCR

取0.2 mL PCR管，配制反應體系：2×SYBR Gree qPCR Master Mix 5 μL；Forward Primer 0.2 μL；Reverse Primer 0.2 μL；Nuclease-Free Water 2.6 μL；cDNA 2 μL。每個反轉錄產物配制3管。PCR擴增程序設置見表2。引物序列表見表3。按照ΔΔCT法計算。

表2 PCR儀擴增程序設置

表3 引物序列

A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內標基因，待測樣本）

B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內標基因，對照樣本）

K=A-B

表達倍數=2-K

2.3.6 免疫組化法檢測大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達

取大鼠踝關節，消毒，取出所需軟骨和滑膜組織，固定，石蠟包埋切片，貼片。免疫組化染色，石蠟切片脫蠟和水化，自來水沖洗2次，PBS洗5 min×3次；修復，3%的過氧化氫孵育15 min；加一抗，37 ℃復蘇35 min，PBS洗5 min×3次；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次；加三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色8 min，鏡下觀察，蘇木素復染，室溫，60 s，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

2.4 統計學分析

采用SPSS26.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示；對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布且方差齊性的資料采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法；不符合正態分布且方差不齊的資料采用非參數檢驗，以P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀態

造模前，各組大鼠毛色柔順，攝食飲水正常，活動靈敏，反應靈活，二便正常，四肢爪甲呈現淡紅色，精神狀態良好，活潑好動；造模后，除空白組外，AA大鼠右側足爪紅腫加重，活動明顯受限，毛色暗淡，攝食飲水減少，便溏，反應遲鈍。見圖1。

圖1 各組大鼠實驗結束足腫脹度的情況

3.2 各組大鼠足容積情況比較

與空白組比較，模型組大鼠在第7～28天足容積顯著升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組在第7～28天足容積顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中劑量在第14～28天足容積升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯低劑量在第7～28天足容積升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中劑量在第14～28天足容積升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯低劑量在第7～28天足容積升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量與來氟米特組比較無統計學意義（P＞ 0.05）。見表4。

表4 各組大鼠不同時間點足容積比較（±s，mL）

表4 各組大鼠不同時間點足容積比較（±s，mL）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

第28天2.06±0.09 2.54±0.13*1.91±0.03^2.01±0.09^ab 2.25±0.15^ab 1.83±0.06^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10第1天1.80±0.09 2.20±0.12 2.26±0.11 2.11±0.07 2.13±0.09 2.10±0.08第7天1.86±0.08 2.88±0.10*2.56±0.14^2.48±0.12^2.62±0.05^ab 2.35±0.14^第14天1.94±0.09 2.80±0.18*2.27±0.18^2.34±0.15^ab 2.56±0.06^ab 2.23±0.16^第21天2.01±0.10 2.80±0.16*2.05±0.09^2.19±0.17^ab 2.45±0.15^ab 1.99±0.09^

3.3 各組大鼠關節炎指數比較

與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組在第7～28天關節炎指數均有下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中劑量在第14～28天關節炎指數升高，差異有統計學意義（P＜0.05），三痹湯低劑量在第7～28天關節炎指數升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量在第7～28天關節炎指數均顯著升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組在第7～28天關節炎指數變化情況無統計學意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠不同時間點關節炎指數比較（±s，分）

表5 各組大鼠不同時間點關節炎指數比較（±s，分）

注：與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

第28天8.50±0.52 6.10±0.45^6.70±0.48^ab 7.25±0.35^ab 5.75±0.54^組別模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10第0天7.50±0.53 7.15±0.85 7.05±0.74 7.25±0.64 7.35±0.48第7天9.20±0.42 7.90±0.73^8.46±0.41^b 8.65±0.42^ab 7.75±0.88^第14天8.95±0.49 7.70±0.58^7.90±0.45^ab 8.00±0.40^ab 6.85±0.67^第21天8.70±0.42 6.73±0.63^7.25±0.54^ab 7.80±0.33^ab 6.45±0.55^

3.4 各組大鼠踝關節滑膜組織病理形態比較

大鼠踝關節HE染色結果顯示：空白組大鼠的踝關節結構比較完整，未見異常的滑膜增生，滑膜細胞排列均勻規整，未見炎性細胞的浸潤，沒有軟骨破壞和新生血管；模型組大鼠可見滑膜組織出現異常增生，細胞排列雜亂，可見明顯的炎性細胞浸潤，并且部分滑膜組織侵入軟骨，出現新生血管的形成；三痹湯低劑量組大鼠踝關節組織細胞排列紊亂，可見滑膜細胞增生，炎性細胞浸潤，血管翳形成，以及壞死的軟骨；三痹湯高、中劑量組和來氟米特組均表現出滑膜組織輕度增生或無增生，炎性細胞浸潤較少，未見明顯的軟骨侵蝕和新生血管，改善情況從強到弱依次為來氟米特組、三痹湯高劑量組、三痹湯中劑量組。見圖2。

圖2 各組大鼠踝關節滑膜組織病理形態（HE，×200）

3.5 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量明顯上升，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中劑量組、三痹湯中劑量加來氟米特組、來氟米特組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量明顯下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量變化比較無統計學意義（P＞ 0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/L）

表6 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/L）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

IL-18 85.87±10.94 159.86±19.76*117.02±20.11^111.84±10.75^b 143.51±14.95^ab 109.14±20.43^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10 IL-1β 16.37±3.13 39.82±4.54*29.24±5.22^31.23±2.74^b 33.49±4.55^ab 27.72±6.84^

3.6 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表7。

表7 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平比較（±s）

表7 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

NLRP3 1.00±0.01 4.62±0.20*1.51±0.05^2.71±0.10^a 3.37±0.21^ab 2.64±0.43^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10

3.7 PCR擴增曲線和熔解曲線

目的基因NLRP3與內參基因GAPDH不同CT值的擴增曲線呈S形，拐點清晰、整體平行性很好，并且目的基因與內參基因擴增曲線傾斜程度相似，說明目的基因與內參基因擴增效率基本一致，擴增良好。擴增產物熔解曲線呈單一峰，其他位置未出現波形，說明產物特異性良好，且無污染。見圖3。

圖3 NLRP3與GAPDH擴增曲線和熔解曲線

3.8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，除三痹湯低劑量組外，其余各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量組滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平變化比較無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖4～5和表8。

圖4 各組大鼠滑膜組織中NLRP3蛋白表達情況（×400）

圖5 各組大鼠滑膜組織中Caspase-1蛋白表達情況（×400）

表8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達比較（±s）

表8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

CasPase-1 38.38±3.86 70.10±4.35*47.73±2.71^56.34±5.55^ab 59.29±3.67ab 55.11±3.51^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 13.29±1.39 51.83±5.41*16.47±1.50^25.09±2.98^ab 31.30±2.24ab 20.83±2.05^

4 討論

痹證的病因為在風寒濕外邪等因素影響下，外邪侵襲導致經脈痹阻，氣血運行失常，以致血瘀氣滯，津停為痰，不通則痛，引發痹痛［9］。發病日久，肝腎虧損，氣血虧虛，元氣大傷，形成虛痹。故痹證的病機總結為正氣不足，衛外不顧。三痹湯以補肝腎、祛風濕、強筋骨為立方依據。痹癥以正氣虧虛為本，風、寒、濕、熱、痰等邪侵襲人體四肢筋骨、關節、肌肉為標，而痹癥病機關鍵即經脈痹阻［10］。三痹湯中人參、茯苓意在治療痹癥日久，正氣虧虛，配伍甘草調和諸藥，降燥烈之性補虧虛正氣；氣血不足，氣虛血弱，不能濡養經脈，血虛則肢體不榮，肢端麻木，運動不靈，氣虛則推動無力，血行瘀阻。方中熟地黃、白芍、當歸、川芎，養血補血，活血化瘀。黃芪益氣固表，扶正祛邪。杜仲具有滋補肝腎及增強肌肉和骨骼的作用。續斷具有調理肝腎、增強肌肉和骨骼以及治療跌打損傷的功效［11］。間歇性活性成分可保護骨組織，具有消炎、鎮痛等作用。獨活、秦艽為治療關節痛的對藥，兩者合用，使其祛風勝濕，除痹止痛功效更佳，正切病機［12］。

通過定期觀察AA大鼠關節腫脹度，筆者發現灌胃給藥結束后三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組大鼠關節腫脹程度以及關節炎指數明顯低于模型組，且三痹湯高劑量及來氟米特組效果最優，差異有統計學意義，同時HE結果也顯示三痹湯高劑量組及來氟米特組較模型組病變程度明顯減輕，踝關節滑膜中只有少量的炎性細胞浸潤，少量血管翳形成，成纖維樣細胞增生較少，關節軟骨增生及骨質破壞較少。三痹湯中劑量組大鼠滑膜損傷較模型組明顯減輕，三痹湯低劑量組大鼠滑膜損傷與模型組大鼠滑膜損傷相比無明顯變化。提示三痹湯有良好的抗炎效果，且藥物療效與給藥劑量有關。在本實驗中，三痹湯高劑量組大鼠與來氟米特組大鼠踝關節病理改善程度基本一致，說明三痹湯同樣可以有效抑制機體炎癥反應，延緩RA進展。總體來說，三痹湯高劑量及來氟米特組對AA大鼠模型組踝關節病變的改善功效基本一致，優于三痹湯中、低劑量組。

RA炎癥反應以炎性因子過量產生為特征，大量高度活化的炎性因子浸潤RA患者滑膜組織內，破壞其軟骨并帶來一系列關節損傷。IL-1β和IL-18這兩種有效致炎因子，能夠迅速招募炎性細胞從而引起一系列炎癥反應，并發揮其免疫作用使RA愈演愈重［13］。為了進一步探討三痹湯對AA大鼠炎癥反應的影響，本研究檢測了各組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量。結果顯示，三痹湯高、中、低劑量和來氟米特都可以明顯降低AA大鼠血清中IL-1β、IL-18含量，尤其是三痹湯高劑量組和來氟米特組，且呈劑量依賴性。三痹湯高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-18含量與來氟米特組大鼠基本一致，說明三痹湯同樣可以有效抑制機體炎癥反應，延緩RA進展。

目前大量研究表明，NLRP3信號通路在RA的發生、發展過程中發揮著重要的作用，其是機體固有免疫的重要組成部分［14］，可通過模式識別受體（PRR）識別內源性或者外源性刺激因素，從而聚集Caspase-1并使其激活，并剪切IL-1β及IL-18的活性前體pro-IL-1β及pro-IL-18，促進其成熟，產生成熟的細胞因子并釋放，最終導致RA過程中的一系列炎癥反應［15］。本研究結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量顯著升高；踝關節滑膜組織中NLRP3、Caspese-1的表達顯著升高；NLRP3 mRNA蛋白表達水平顯著升高，可知NLRP3炎性信號通路的激活參與了RA的發病過程。通過病理檢查不難發現，模型組病變最為嚴重，大量炎性細胞浸潤及肉眼可見的腫脹，這提示我們NLRP3的激活對炎癥的發生、發展具有很大的促進作用。經過相應藥物治療后，三痹湯高、中、低劑量組以及來氟米特治療組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量均降低；踝關節滑膜組織中NLRP3、Caspase-1的表達均降低；NLRP3 mRNA蛋白表達水平降低。模型組可能因NLRP3信號通路上游因子NLRP3、Caspase-1激活而致下游因子IL-1β、IL-18合成分泌過多，引起炎性細胞聚集，因而引起關節腫脹、活動受限，而三痹湯發揮其抗炎、鎮痛、保護骨組織及提高免疫力等功效，可能通過抑制NLRP3信號通路上游因子NLRP3、Caspase-1的激活阻止IL-1β、IL-18的生成，從而達到對AA大鼠的治療作用。通過觀察三痹湯各劑量組對降低大鼠足容積、關節炎指數評分以及炎性因子水平的影響，發現治療效果呈劑量依賴性。其中三痹湯高劑量組效果最好，其次是三痹湯中劑量組，三痹湯低劑量組效果最差。來氟米特組大鼠踝關節滑膜組織中NLRP3通路相關蛋白因子表達均低于三痹湯中、低劑量組，而三痹湯高劑量組低于來氟米特組，說明高劑量三痹湯在抑制NLRP3信號通路相關蛋白因子表達方面強于來氟米特。

5 結論

三痹湯能夠減輕AA大鼠關節腫脹度，改善滑膜組織病理損傷，并通過抑制NLRP3信號通路的激活，降低大鼠血清IL-1β、IL-18水平，對佐劑型關節炎大鼠起到治療作用。