Egl-9家族缺氧誘導因子1的研究進展及與肺癌的關系

白巧會 艾 麗 蔣 絨 李永霞

昆明醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，云南昆明 650000

Egl-9 家族缺氧誘導因子1（Egl-9 family hypoxia inducible factor 1，EGLN1）作為氧傳感器在動物及人體的大腦、腎臟、皮膚、心臟、肺等27 種器官中廣泛表達。在有氧條件下，EGLN1 羥基化缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）亞基，使HIF-1α 被E3-泛素連接酶復合物底物希佩爾林道蛋白（von Hippel-Lindau protein，pVHL）接頭特異性識別并使其泛素化，從而導致HIF-1α 蛋白酶體降解。相反，在缺氧時，EGLN1 不活躍，HIF-1α 亞基穩定，激活導致細胞適應缺氧的轉錄程序[1]。因此，EGLN1 被稱為在缺氧誘導因子介導的缺氧信號通路中起核心作用的蛋白。研究證實EGLN1 在人類許多腫瘤中表達，對腫瘤的生長、血管生成、轉移皆有影響，但具體機制尚不完全清楚。根據EGLN1 在不同的細胞環境下介導的調節反應不同，EGLN1 又被定義為腫瘤抑制基因或癌基因[2-3]。

1 EGLN1的結構及作用機制

1.1 EGLN1的結構特征

EGLN1 包含一個具有7 個半胱氨酸殘基的N端鋅指結構域、一個具有7 個保守的半胱氨酸的催化結構域（殘基181-426）和一個具有1 個半胱氨酸的中間間隔區。研究提示，EGLN1 中的部分半胱氨酸殘基容易發生氧化，尤其是半胱氨酸殘基127、201 和208，而半胱氨酸殘基208、266、302、323 和/或326 的氧化可導致EGLN1 的自我失活，游離半胱氨酸卻可防止EGlN1 中對其功能至關重要的特定半胱氨酸殘基的氧化[4]。

1.2 EGLN1的作用機制

EGLN1、EGLN2 和EGLN3 分別編碼脯氨酰羥化酶結構域（prolyl hydroxylase domain，PHD）中的PHD2、PHD1 和PHD3，因此EGLN1 也通常稱為PHD2。在常氧條件下，通過RNA 干擾沉默PHD2會增加HIF-1α 表達水平，而沉默PHD1 和PHD3均未觀察到這種效果，因此EGLN1 被認為是關鍵的氧傳感器。EGLN1/HIF-1α 通路是缺氧反應的關鍵調節因子。在常氧條件下，EGLN1 以氧氣和2-羥基戊二酸作為底物，Fe（Ⅱ）和抗壞血酸作為輔助因子，羥基化HIF-1α 的氧依賴性降解（oxygendependent degradation，ODD）結構域，導致HIF-1α蛋白急劇降解。在缺氧期間，這種羥基化被阻斷，導致HIF-1α 積累，從而影響機體血管生成、紅細胞生成、糖酵解以及鐵代謝。

1.2.1 EGLN1 與紅細胞生成 紅細胞生成主要受促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）的調節，EPO的轉錄受到缺氧反應途徑的嚴格調控以維持氧穩態，而HIF-α 亞基的第一個特征異構體HIF-1α 被認為是調控EPO 合成的主要HIF-α 異構體。研究發現，敲除小鼠的PHD2 導致EPO 的增高和紅細胞增多癥的發生，敲除腎間質細胞（EPO 主要來源）的PHD2 則導致了顯著的紅細胞增多癥，而PHD2 是引起HIF-1α 羥基化的主要因子，提示EGLN1 基因的種系缺陷可能通過減少HIF-1α 的羥基化導致EPO 過表達，從而引起繼發性遺傳性紅細胞增多癥[5]。大量研究提示，血紅蛋白濃度、血氧飽和度也與EGLN1 的表達顯著相關[6-8]。血紅蛋白是紅細胞中攜帶氧氣的主要成分，血氧飽和度是動脈血中氧氣與血氧飽和度結合程度的指標，因此推測血紅蛋白濃度、血氧飽和度與EGLN1 的關系與EGLN1調節紅細胞生成作用有一定的聯系，但具體機制尚需進一步研究。

1.2.2 EGLN1 與糖酵解 在有氧條件下線粒體中丙酮酸的分解是大多數細胞的能量來源，而在可用氧氣減少后，細胞將新陳代謝轉向無氧糖酵解。在轉錄水平上將有氧代謝轉變為無氧代謝的關鍵因素之一是HIF-1α，而HIF-1α 的蛋白質穩定性主要受EGLN1 的調節。Guentsch 等[9]研究發現敲低PHD-2 的巨噬細胞HIF-1α 蛋白穩定化，HIF 靶基因丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK1）的表達增強，導致丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）磷酸化，PDH 失活，細胞代謝向糖酵解轉變。因此EGLN1 可能通過調控HIF-1α/PDK1 途徑影響細胞糖酵解。

1.2.3 EGLN1 與鐵代謝 EGLN1 編碼的PHD2 是一種氧/鐵傳感器，屬于2-氧代戊二酸（2-Oxoglutaric acid，2-OG）依賴性雙加氧酶超家族。哺乳動物中的鐵調節蛋白2（iron regulatory protein 2，IRP2）可被2-OG 依賴性雙加氧酶特異性抑制劑二甲基草甘氨酸穩定。有研究提示，HIF-1α 也是一種鐵穩態相關蛋白[10]。因此，EGLN1 很可能通過下調HIF-1α和IRP2 抑制鐵代謝。腦鐵代謝功能障礙，特別是黑質中的鐵積累，通過增加氧化應激、損害泛素蛋白酶體系統和α-突觸核蛋白聚集促進帕金森病的發生。Chiang 等[11]通過對EGLN1 基因的c.380 G＞C（p.C127S）變異體在臺灣帕金森患者中作用的研究，發現EGLN1 的保護性C127S 變異體與降低帕金森病風險相關。

2 EGLN1在腫瘤中的表達及意義

2.1 抑制腫瘤血管形成

腫瘤的快速生長需要新生毛細血管為其提供足夠的氧氣和營養。Chan 等[12]研究發現在結直腸癌中，與鄰近正常結直腸組織相比，腫瘤中PHD2 的mRNA 和蛋白質水平均降低。敲低PHD2 的結腸癌細胞（HCT116）條件培養基有明顯的體外血管形成，而未敲低PHD2 的對照HCT116 細胞條件培養基卻無體外血管形成，且PHD2 被敲低的HCT116細胞條件培養基中促血管生成因子血管生成素（angiopoietin，ANG）和白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）蛋白水平升高。在PHD2 沉默的細胞中，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性升高，而IL-8 是一種特征明確的NF-κB 靶標，ANG 的啟動子也可與NF-κB 結合，這些結果提示EGLN1 可能通過影響NF-κB/ANG、IL-8 信號通路抑制腫瘤血管形成。

2.2 促進p53泛素化

腫瘤蛋白p53 被稱為基因組的守護者，與腫瘤發生、自我更新、分化和重編程中的可塑性有關。研究提示，p53 的缺失或突變會導致細胞去分化和獲得癌干細胞特性[13]。Sun 等[14]研究提示EGLN1的表達與鼻咽癌患者的腫瘤臨床分期呈正相關，EGLN1 的過表達可促進鼻咽癌細胞的增殖、侵襲、遷移，誘導鼻咽癌細胞干細胞樣表型，降低鼻咽癌細胞對放療的敏感性，并進一步證實了其內部機制是EGLN1 與p53 的相互作用促進了泛素化酶系統介導的p53 破壞，并以羥化酶依賴性方式減少了p53 途徑的激活。

2.3 羥基化HIF-1α抑制VHL與其他底物結合

VHL 是一種重要的抑癌基因。EGLN1 羥基化的HIF-1α 是VHL 的重要底物，可與VHL 的其他底物競爭VHL 的結合位點，抑制VHL 與其他底物結合。Liu 等[15]研究發現Scm 樣含四mbt 域1（scm-like with four mbt domains 1，SFMBT1）可能為VHL 的另一種底物。EGLN1 羥基化的HIF-1α與VHL 結合，抑制了SFMBT1 與VHL 的結合，導致SFMBT1 的泛素化和降解減少，從而促進了腎腫瘤細胞的生長和增殖。Price 等[16]研究發現EGLN1的基因敲除和小分子抑制降低了卵巢癌腫瘤細胞的生長并抑制了腫瘤增殖，HIF-1α 低表達的癌癥對EGLN1 治療無反應，而HIF-1α 高表達的部分患者會有反應，提示EGLN1 的促癌作用表現出很強的HIF 依賴性。

盡管EGLN1 是一種對HIF 通路具有關鍵調節作用的氧傳感器，但它也與一些其他非HIF 蛋白的調節有關，例如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）[17]、NF-κB[18]、N-myc下游調節基因3（N-myc downstream-regulated gene 3，NDRG3）[19]。EGLN1 在中樞神經系統癌、頭頸癌、腎癌、肝癌和肺癌中通常上調，但在結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌中可能下調[20]。因此EGLN1 在癌癥進展中的作用仍存在爭議，考慮與其在不同細胞環境下具有多種功能有關。

3 EGLN1與肺癌的關系

肺癌是全球范圍內最常見的癌癥，也惡性程度最高的腫瘤之一。然而，肺癌的發病機制和預后標志物均不完全清楚。Chen 等[21]利用TCGA 和GEO數據集分析發現13 個與肺癌生存顯著相關的基因，其中8 個風險基因（CBFA2T3、DENR、EGLN1、FUT2、FUT4、PCDH7、PHF14 和STX3）中6 個基因可作為獨立的肺癌預后標志物，CBFA2T3 和STX3是保護基因，而DENR、EGLN1、FUT4 和PCDH7 是危險基因。EGLN1 作為肺癌相關風險基因與腫瘤增殖和炎性浸潤有關，在肺癌中具有潛在功能和預后價值。

鐵死亡是一種新發現的非凋亡性細胞死亡模式，在腫瘤生物學和治療中發揮重要作用，激活鐵死亡可促進腫瘤細胞的死亡，染色質重塑蛋白淋巴特異性解旋酶（lymphoid-specific helicase，LSH）通過促進脂質代謝相關基因在癌變過程中發揮重要的鐵死亡抑制劑的作用。Jiang 等[22]研究提示，LSH 在肺癌中作為致癌基因起作用，而EGLN1 可通過抑制HIF-1α 誘導LSH 表達。Lanikova 等[23]發現選定的西藏EGLN1/PHD2 單倍型與肺癌之間存在顯著關聯，其發生肺癌的風險增加兩倍。

EGLN1 上調與非小細胞肺癌的不良預后相關[24]。然而，非小細胞肺癌的主要組織學亞型肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）在分子和臨床特征上存在顯著差異。Xu 等[25]研究發現LUAD和LUSC 患者癌組織中EGLN1 表達水平均高于其各自相鄰的正常組織。然而，Kaplan-Mei-er 生存曲線顯示，與低表達組相比，高EGLN1 表達的LUAD 患者總生存期（overall survival，OS）和無復發生存期（relapse-free survival，RFS）顯著縮短，但在LUSC 患者中卻無這些差異。提示EGLN1 基因的高表達可能僅作為LUAD 患者預后不良有價值的生物標志物。

為深入了解EGLN1 在肺腺癌發生中的作用，Reggiani 等[26]評估了EGLN1 在（TCGA）-LUAD隊列和其所在研究所的生物庫中檢索到的一組患者樣本中的表達水平，結果腫瘤組織中EGLN1 基因的mRNA 和蛋白質表達水平均顯著高于周圍健康肺組織，高EGLN1 表達也與較差的預后相關，并且在Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog，KRAS）突變的患者中，OS 的差異更為明顯。用EGLN1 抑制劑莫立司他處理的肺腺癌細胞系均對莫立司他敏感，并且KRAS 突變的細胞系顯示出最高的靈敏度，這些提示EGLN1 基因在KRAS 突變的肺腺癌中具有更明顯的促癌功能。肺腺癌是最常見的肺癌亞型，而化療藥物和分子藥物對部分KRAS 突變的肺腺癌患者的治療幾乎是無效的，因此EGLN1 很可能成為KRAS 突變肺腺癌新的治療靶點。

4 展望

EGLN1 已被廣泛報道為導致HIF 泛素化和蛋白酶體降解的因子。HIF 在腫瘤中的功能已得到很好的表征，但對EGLN1 在腫瘤中功能的了解還遠遠不夠。EGLN1 活性的調節，可能成為缺氧、鐵代謝異常等疾病，尤其是腫瘤疾病治療的切入點。EGLN1 在不同疾病中的作用機制不同，其mRNA 水平、蛋白水平、蛋白活性調控、穩定性的相關機制還有待進一步發現和證實。肺癌的發病率不斷上升，病死率居高不下，給社會帶來巨大負擔。隨著對分子免疫機制的研究以及腫瘤對放化療敏感度的下降，靶向治療越來越受到人們的青睞。了解EGLN1在癌癥中的具體作用機制，將會為靶向藥物的研發提供新的思路。