柚皮素對腦缺血再灌注損傷神經保護機制及作用靶點研究進展

胡中強 楊悅 李明闊 李琛

缺血性腦卒中是卒中最常見的類型,起病急進展快,因其高發病率、高致死致殘率,往往預后不良且給家庭造成較重的經濟負擔[1],早期診斷積極的治療對于改善缺血性腦卒中病人后期的神經功能具有十分重要的意義。目前,缺血性腦卒中的超早期治療主要是通過靜脈溶栓以盡早恢復缺血腦組織血供,改善神經細胞缺血缺氧狀態,減輕神經細胞損傷進而改善神經功能。然而,在缺血區腦組織血供恢復的同時,往往會出現神經功能一過性恢復后損傷不減反增、病情惡化的現象,即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,I/R損傷)[2]。近年來,腦缺血再灌注損傷的相關機制吸引越來越多國內外學者的關注,成為目前研究的熱點話題之一。最新研究發現,腦缺血再灌注損傷的發生機制主要與神經細胞炎性反應、氧化應激、氮化應激、酸中毒、線粒體功能障礙、Ca2+超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、血腦屏障破壞、興奮性氨基酸過度釋放等因素密切相關[3,4],而各種機制之間相互作用、相互疊加,產生瀑布樣級聯反應,進一步放大再灌注神經細胞損傷加重神經功能缺失。近年研究表明,積極的缺血后處理對于減輕缺血再灌注損傷顯得十分重要[5]。因此,如何減輕或避免缺血性腦卒中再灌注損傷,減輕神經細胞損傷,改善神經功能損傷,改善患者預后,提高生活質量顯得極為重要。柚皮素(Naringenin,4,5,7-三羥基黃酮,NAR)是一種天然存在的二氫黃酮類化合物,一般以柚皮苷的形式存在于如葡萄柚、橘子、檸檬等蕓香科植物中,是傳統中藥枳實、枳殼中的重要有效成分,自然界中來源廣泛,而且可以通過血腦屏障,在神經系統臨床用藥中具有一定的先天優勢[6-8]。常溫下,柚皮素的水溶性和脂溶性很低,導致其口服生物利用率較低[9],在體內較難產生可靠的藥效。樊慧蓉等[10]通過大鼠實驗發現,柚皮素體內代謝包括Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝,代謝產物主要以Ⅱ相代謝產生的的葡萄糖醛酸結合物為主,并通過肝腎代謝后排出體外。目前,有學者通過采取制備柚皮素-PLGA納米粒[11]、脂質體[12]、磷脂復合物[13]等的方式來提高柚皮素的生物利用率并取得了一定的成功,使得柚皮素的臨床應用前景更加開闊。近年研究表明,柚皮素對于腦缺血再灌注損傷后神經保護具有顯著的作用,而這是通過不同的通路或作用機制來實現的,本文就柚皮素對腦缺血再灌注損傷神經保護機制及作用靶點相關研究進展進行歸納總結,以期為柚皮素治療腦缺血再灌注損傷機制進一步探討與開發利用提供理論基礎。

1 抗炎作用

腦梗死早期,神經細胞因缺氧缺血開始出現不可逆性損傷,在缺血中央區域形成缺血壞死區,神經細胞因缺氧缺血短時間內大量死亡,周圍形成缺血半暗帶(ischemic penumbra,IP),如能及時改善缺氧缺血狀態,可避免形成壞死,是腦梗死現代治療的理論基礎;但壞死組織可激活體內免疫應答,激活小膠質細胞轉化形成巨噬細胞,進而清除缺血壞死區腦組織,并同時誘導炎性介質產生,進一步加重周圍腦組織炎性反應[14,15]。如何抑制炎性介質產生、抑制小膠質細胞激活是減輕炎性反應的關鍵。目前,積極有效的抗炎治療是預防腦缺血再灌注損傷最有效的方法[16]。核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路廣泛存在于機體內各種細胞,參與機體的炎癥反應、應激和免疫應答,并在免疫應答的調控中起著關鍵作用。研究表明,NF-κB信號通路與腦缺血再灌注損傷后炎癥反應關系密切,調節因子蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可通過活化NF-κB介導的信號通路,促進白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎癥因子的表達[17,18],而柚皮素可通過抑制蛋白激酶C的磷酸化抑制NF-κB介導的信號通路減少炎癥因子的釋放進而發揮抗炎作用[19]。Bai等[20]通過大鼠實驗發現,柚皮素對缺血腦組織神經保護功能是通過下調核苷酸寡聚化結構域樣受體2(nucleotide oligomerization domain-like receptors 2,NOD2)、受體相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2, RIP2)、 NF-κB、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達并上調血腦屏障緊密連接相關蛋白claudin-5蛋白的表達實現的。Olugbemide等[21]進一步研究后認為,柚皮素通過調控NF-κB和腦神經營養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的表達來調節氧化炎癥損傷,進而改善缺氧應激小鼠的精神行為。Raza等[22]通過動物實驗并分析免疫組化及免疫印跡后證實,柚皮素通過下調NF-κB的表達水平,抑制NF-κB介導的神經炎癥,同時,柚皮素還可以限制神經膠質細胞的激活,抑制中樞神經系統炎癥反應,進而改善神經功能及預后。Satoshi Okuyama等[23]實驗發現,柚皮素對于阻止小膠質細胞和星形膠質細胞的過度激活具有顯著作用,同時對缺血后海馬區神經細胞死亡具有抑制作用,而海馬結構是否完整與腦缺血再灌注損傷后的神經功能障礙嚴重程度關系密切[24]。

2 抗氧化作用

氧化應激是細胞代謝過程中一種無法避免的現象,但有學者認為過度的氧化應激可導致細胞出現死亡。作為缺血再灌注損傷的核心環節,腦缺血再灌注損傷時,神經細胞內氧化與抗氧化作用失衡,產生大量氧自由基[25],并攻擊恢復血供的神經細胞和周圍正常神經細胞,進一步加重神經功能損傷[26,27]。柚皮素作為一種良好的天然抗氧化劑,在腦缺血再灌注損傷的神經保護中具有重要地位,對減輕神經系統氧化反應、改善神經功能預后具有重要作用。既往研究表明,核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號通路在抗氧化應激過程中發揮重要作用[28],是體內調節抗氧化過程的有效途徑,通過調控偶聯反應和細胞抗氧化能力控制基因的表達,減少自由基產生,提高機體抗氧化作用,來維持體內氧化與抗氧化作用平衡進而使細胞處于氧化還原穩態[29],從而減少神經元凋亡以保護神經細胞[30]。研究表明,通過激活體內Nrf2/HO-1信號途徑可促進抗氧化蛋白HO-1的表達從而發揮對大腦神經細胞缺血再灌注損傷的保護作用進而改善和修復受損的神經功能[31]。目前,柚皮素通過Nrf2/HO-1通路作用于機體其他細胞相關研究較為廣泛,而其在神經功能保護方面機制正成為研究熱點[32]。有研究發現,柚皮素治療可降低外周血中炎細胞水平,抑制炎癥因子的釋放,提高Nrf2和HO-1蛋白表達,減輕細胞氧化應激[33]。王毅華等[34,35]通過構建體外原代大腦皮層神經細胞培養氧糖剝奪/再灌注(Oxygen-glucose Deprivation and Reperfusion,OGD/R)模型證實,柚皮素可通過激活Nrf2介導的抗氧化途徑,改變體內氧化與抗氧化失衡狀態,進而減輕神經細胞氧化損傷以保護神經功能。同時,還有研究表明,Nrf2/ARE信號通路具有抗氧化、抗細胞凋亡、神經保護等多種作用,柚皮素通過Nrf2/ARE信號通路也可減輕氧化應激并改善線粒體功能實現神經功能保護[36],但關于Nrf2/ARE信號通路更深入的研究有待進一步展開。

3 減輕腦組織水腫作用

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是調節水分子轉運的重要結構,目前已知的有13種亞型,其中水通道蛋白4 (Aquaporin 4,AQP4)主要位于中樞神經系統參與腦血管與周圍神經組織水分子轉運[37],研究表明AQP4與腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成關系密切[38]。王娟等[39]研究發現,柚皮素與腫瘤壞死因子TNF具有良好的結合性,通過減少組織中TNF的含量減輕炎性反應進而減輕腦水腫。Gaur等[40]給予50 mg/kg和100 mg/kg的柚皮素處理后大鼠腦組織水腫及氧化損傷明顯減輕,同時鏡下觀察發現實驗大鼠腦組織病理改變顯著逆轉。Somuncu等[41]給予腦缺血再灌注損傷后腦水腫大鼠模型上述劑量柚皮素處理,進一步研究發現柚皮素可顯著降低大鼠體內升高的腦組織AQP4IL-2和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHDG)水平。此外,當發生缺血性卒中時,血腦屏障可因此受到破壞,作為存在于腦組織與周圍血管之間的天然屏障,血腦屏障在平衡腦組織與外周交換中起重要作用,在腦組織恢復再灌注時,因缺少天然屏障的保護,神經系統內環境可發生紊亂,亦可導致水鈉潴留,加重腦水腫。Han等[42]在研究中發現,柚皮素通過減輕氧化應激和細胞凋亡改善血腦屏障的損傷進而減輕神經功能損傷和腦水腫。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介導的信號通路能夠引起內皮細胞增生,致使其通透性增強,誘發血管腫瘤以及血管滲透,從而使周圍水腫及炎癥形成。柚皮素可通過調控VEGF信號通路抑制血管內皮生長因子的表達,抑制新生血管形成,改善神經系統水鈉交換,減輕腦水腫,促進神經細胞血液灌注,改善神經功能損傷[43]。由此可見,梗死后腦組織水腫是多種因素作用的結果,柚皮素可通過不同途徑分別減輕腦組織水腫,這是與腦缺血再灌注損傷病理生理發展中多因素相互作用過程相符的。

4 抗細胞凋亡作用

當腦梗死發生時,梗死中心區域腦組織因缺血發生壞死,而周圍區域則表現為缺血半暗帶,早期溶栓治療旨在恢復缺血半暗帶這一區域的血供,改善損傷的神經功能。而缺血半暗帶區域腦組織在血供恢復的過程中常表現為延遲性程序性死亡,即細胞凋亡。細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用,可導致神經功能不可逆性損傷進一步加重,相關研究表明,這與多種因素如過量的氧自由基、炎性因子、線粒體損傷、鈣超載等有關[44]。大量研究證實,缺氧誘導因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)在減輕腦缺血再灌注損傷造成的細胞凋亡中起重要作用[45,46]。Ni等[47]通過觀察發現,激活HIF-1α/VEGFA途徑可以明顯減輕腦腦缺血再灌注損傷。Cao等[48]研究證實,柚皮素可靶向作用于核因子-κB亞型1(Nuclear factor kappa B subunit 1,NFKB1)來調控HIF-1α/AKT/mTOR信號通路控制調節凋亡相關蛋白的表達,進而預防氧糖剝奪/再灌注誘導的PC12細胞凋亡。另有研究表明,鈣離子參與體內多種細胞活動,當神經細胞灌注恢復后,細胞內出現大量鈣離子,即鈣超載[49]。體內鈣超載主要與谷氨酸受體過度激活[50]、生物膜離子通道功能異常[51-53]、高爾基體[54]、鈣調蛋白功能異常[55]等因素有關。體內過多的鈣離子可通過氧化應激、內質網應激[56]及線粒體損傷[57]等多種途徑誘導細胞凋亡。研究認為,柚皮素可增加鈣結合蛋白含量,進而降低細胞內的游離鈣離子濃度,從而改善鈣超載狀態,減輕細胞凋亡[58]。目前,國內外關于柚皮素對體內鈣超載的影響多集中在以鈣超載為中心的上下作用環節,單純針對鈣超載的相關研究比較匱乏,而鈣超載是神經細胞腦缺血再灌注損傷多種作用的共同通路,因此針對柚皮素作用于腦缺血再灌注損傷后鈣超載通路相關機制具有廣泛研究價值。

5 調節線粒體自噬作用

線粒體是機體內生物氧化和能量轉換的重要場所,通過氧化磷酸化途徑為細胞內多種生命活動提供能量。當缺血缺氧時,線粒體內呼吸鏈結構和功能隨之出現異常,功能酶活性顯著降低,影響正常生物代謝及信號傳導過程,進而導致線粒體損傷,神經細胞出現線粒體相關性程序性凋亡[59]。當缺血腦組織恢復再灌注時,氧化應激、炎癥反應、鈣超載等多種病理過程進一步加重線粒體損傷[60]。王凱華等[61]通過構建大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型證實,柚皮素可增強線粒體自噬來減少細胞內腫脹損傷的線粒體,進而減輕神經細胞凋亡,發揮神經保護作用。同時,有研究發現,當缺血腦組織恢復再灌注時,可導致線粒體自噬過度激活,使得結構和功能完整的線粒體一同被清除[62]。因此,在恢復再灌注減輕細胞損傷的同時,如何避免線粒體自噬過度激活顯得尤為重要。國內外研究發現,柚皮素對于線粒體自噬的調節,可能與腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)介導的信號通路有關[63,64]。但是目前更進一步的研究較為缺乏,而線粒體自噬作為腦缺血再灌注損傷中重要的一個環節,與氧化應激、炎癥反應、鈣超載等多種病理過程和細胞凋亡關系密切,對于神經細胞保護起著承上啟下的作用,因此,針對柚皮素對于線粒體自噬調節的研究需要進一步補充。

腦梗死是目前威脅人類健康的一大常見原因,因其高致殘、高經濟負擔被人們所忌憚,超早期靜脈溶栓對恢復梗死區域缺血半暗帶腦組織血供、減輕神經功能損傷、改善患者預后具有關鍵作用,是目前治療腦缺血性卒中血管內治療最主要的手段之一。然而,在缺血腦組織恢復血供的同時,再灌注損傷卻能導致本未完全恢復的神經損傷進一步加重,如何減輕腦梗死患者超早期靜脈溶栓后再灌注損傷是目前國內外研究的熱點話題之一。腦梗死溶栓后再灌注損傷絕非單一機制造成的,而各種機制之間又相互影響相互作用,形成滾雪球效應,損傷不斷放大,加重神經功能損傷。然而現階段研究多針對腦缺血再灌注損傷的某一個環節或靶點展開,不能夠整體而系統的把握疾病發展與轉歸,這與腦缺血再灌注損傷各機制相互作用、瀑布樣放大的病理發展特征背道而馳,整體而系統的把控腦缺血再灌注損傷發病機制,對于疾病的更深層次的研究及治療顯得尤為重要。

柚皮素作為一種廣泛存在的天然藥物,價格低廉,副作用小,廣泛應用于多個中藥方,對于腦梗死患者的治療已具有一定的經驗。近年來,柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經保護機制及作用靶點研究中取得了大量令人矚目的成果,其透過血腦屏障的能力暗示著其在神經系統用藥的廣泛前景。柚皮素可以同時作用于腦缺血再灌注損傷疾病轉歸中的多個節點減輕神經細胞損傷改善神經功能,通過調控體內多種信號通路發揮其抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用實現保護腦缺血再灌注損傷后神經功能的目的。但是柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經保護機制及作用靶點的研究仍有許多方面需要進一步深入。首先,目前大量研究發現柚皮素對于腦缺血再灌注損傷神經保護作用確切且對于其作用機制與作用靶點具有一定了解,但是如上所述,為發揮更好的療效,仍有一部分機制需要進一步明確。其次,柚皮素雖已實現大量制備且實驗中可穩定釋放藥效,但該藥物研究主要處在動物實驗階段,而在臨床試驗研究階段相對較少,因此需要對柚皮素進一步探索和研究,爭取早日開展規范、正規的臨床試驗,以期為實現早日臨床推廣提供充分的理論依據。相信隨著動物實驗研究的有序進展和臨床實踐的逐步推進,柚皮素在腦缺血再灌注損傷神經保護機制及作用靶點的研究定會取得突破性進展,柚皮素在腦缺血再灌注損傷治療與預防中定會進一步發揮重要作用。