混合菌劑對葡萄白粉病發生及葉際微生物多樣性的影響

杜鴻燕，何濤，陳吉越，胡祥，史亮濤，劉海剛，楊順林*，杜飛*

（1.云南省農業科學院熱區生態農業研究所，云南元謀 651300；2.云南農業大學教育部農業生物多樣性與病害控制重點實驗室/農業生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南昆明 650201）

云南是我國鮮食葡萄的重要產區，2021年全省葡萄栽培面積3.93萬 hm2[1-2]。在葡萄種植過程中，由白粉菌目鉤絲殼屬葡萄白粉菌（Uncinula necator(Schw.)Burr.）引起的白粉病，會導致葡萄葉片黃化、脫落，嚴重時導致樹體停止生長[3]，給生產帶來巨大損失。隨著避雨栽培面積加大，不同地區的白粉病也有加重的趨勢，影響了云南葡萄產業的發展。

目前葡萄病害的防治仍以化學藥劑為主，腈菌唑和吡唑醚菌酯均具有低毒、廣譜、高效等特點[4-5]。解淀粉芽孢桿菌為有益菌，能誘導植物產生抗性，增加與植物抗病性相關的酶活性[6]。然而，在使用單一菌劑防治葡萄白粉病時，由于菌劑的廣譜性，常產生特異性脫靶作用，對葡萄葉際微生物產生嚴重影響，因此，在施用農藥時結合不同類型藥劑并科學合理地混用一些生防菌劑，可促進植物生長，增強植物抗性[7-9]。有研究發現，使用農藥后能在科和屬水平上降低葉際細菌群落的相對豐度，這與和植物生長及營養補充功能相關的某些菌群變化有關[10]，頻繁使用異菌脲也會對植物葉際及根際微生物群落結構造成顯著影響[11]，但關于施用混合菌劑對葡萄葉際微生物影響的研究鮮有報道。

近年來，研究葉際微生物多樣性大多采用高通量測序方法，與傳統的微生物研究方法相比，基于Illumina高通量測序能更全面地反映微生物在不同水平上的相對豐度及變化情況，結合生物信息學、人工可控的植物-微生物互作系統等方法，能為現代農業中通過調控微生物群落的變化，促進植物健康狀況提供更多依據。劉利玲[12]采用基于16S rRNA和ITS1基因的MiSeq高通量測序技術發現，青楊雌雄株具有不同的葉際微生物菌群和顯著富集的菌群。楊蕾等[13]利用高通量測序技術對有青苔病癥和無病癥的柑橘葉際真核生物的群落結構組成多樣性及差異進行了研究，發現優勢門為鏈形植物門（Streptophyta）、子囊菌門（Ascomycota）等。

在微生物多樣性的研究中，可以通過單樣本的多樣性（Alpha多樣性）分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。群落豐富度（Community richness）的指數有：Chao、Ace；群落多樣性（Community diversity）的指數有：Shannon、Simpson。Shannon是用來估算樣本中微生物多樣性的指數之一，它與Simpson多樣性指數類似，常用于反映群落Alpha多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Simpson也是用來估算樣本中微生物多樣性的指數之一，由Edward Hugh Simpson于1949年提出，在生態學中常用來定量描述一個區域的生物多樣性，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。

本文將化學菌劑和生防菌劑合理混用后，采用Illumina高通量測序技術結合生物信息學對葡萄葉際微生物群落的結構及功能進行研究，并在田間進行病害調查，計算病情指數及混合菌劑防效，旨在明確混合菌劑農藥對葡萄葉際微生物群落結構及白粉病發生的影響，以期為混劑農藥研發、合理施用及生防菌的篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為樹齡11年的‘紅地球’葡萄，在簡單的避雨栽培模式下，主要病害為葡萄白粉病和霜霉病，近五年內除了在這兩種病害的發病期施用預防治療藥劑外，未施用過其他農藥。供試藥劑主要有40%腈菌唑（Myclobutanil）懸浮劑（江蘇耘農化工有限公司），25%吡唑醚菌酯（Pyraclostrobine）懸浮劑（江蘇劍牌農化股份有限公司），解淀粉芽孢桿菌微生物葉面肥（有益微生物≥10億 cfu?mL-1，云南省微生物發酵工程研究中心有限公司）。

供試儀器主要有電動農藥噴霧器（20 L，濰坊鑫浩德機械有限公司）、超凈工作臺（V1500V010810JU，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）、高速冷凍離心機（5430 R，Eppendorf Centrifuge）、超聲波清洗機（SY3100DH，40 KHz，上海聲源超聲波儀器有限責任公司）、高通量組織破碎儀（Wonbio-96c，上海萬柏生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

試驗于2020年8月在云南農業大學現代科研教學實踐中心（103°40'E，25°23'N，海拔1920 m）葡萄基地進行，采用隨機區組設計，設置混合殺菌劑（SW）處理：3000倍吡唑醚菌酯＋3000倍腈菌唑＋100倍解淀粉芽孢桿菌，無菌水（CK）處理為對照，設置每小區面積為40 m2，3個重復。2020年8月19日首次噴藥，之后每7 d施藥1次，共3次。采用小型噴霧器進行噴施，均勻噴灑在葉片上，每小區用藥量為3.6 mL吡唑醚菌酯＋1.8 mL腈菌唑＋27 mL解淀粉芽孢桿菌，殺菌劑混合方式及用量經田間篩選[16]。

1.2.2 樣品的采集及前處理

于第3次施藥24 h后取樣并進行病害調查，以隨機均勻取樣為原則，每個處理選擇6株長勢相似的葡萄樹，采集朝向、大小、離地面高度均一致，新梢第7～8片無雨滴露珠的葉片，每處理6個重復，保存于50 mL無菌離心管中，并立即置于干冰盒中帶回實驗室。將采集的葉片樣品取出，在無菌超凈工作臺中加入10 mL·g-1PBS緩沖液（0.1 mol·g-1，pH＝8.0），在40 KHz下超聲15 min，渦旋10 s（20 ℃，200 r·min-1），重復潤洗2次，然后將各樣品的2次洗脫液（20 mL）收集至離心管中，離心（4 ℃，13000 r·min-1）10 min，棄上清液，收集沉淀。

1.2.3 葡萄葉際微生物總DNA提取與PCR擴增

將收集的沉淀取出，用Mp Fast DNA?Kit（6560-200）試劑盒抽提DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000檢測提取的DNA的質量。細菌采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對V3-V4可變區進行擴增，真菌采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對ITS1區進行PCR擴增，引物為上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。

20 μL擴增體系：4 μL 5×FastPfu緩沖液、0.4 μL聚合酶FastPfu、2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1）、0.8 μL上游引物（5 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（5 μmol·L-1）、1 μLDNA模板（10 ng·μL-1），ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，30個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩定延伸10 min，10 ℃保存，擴增后的DNA經純化混勻后送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序，每個處理測定6個樣品。

1.2.4 Illumina Miseq測序數據處理及比對

使用Fastp軟件對原始序列數據進行質控，使用Flash軟件進行拼接，使用Uparse軟件設置97%相似度對序列進行Operational Taxonomic Units（OTU）聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier算法對每條序列進行物種分類注釋，設置比對閾值為70%，與16S rRNA數據庫Silva、ITS數據庫Unite進行比對。

利用PICRUSt和FUNGuild（Fungi Functional Guild）對測序結果進行功能預測。PICRUSt是針對16S擴增子測序結果進行功能預測的一款軟件包。首先通過PICRUSt（PICRUSt流程存儲greengene id對應的COG信息和KO信息）對OTU豐度表進行標準化，即去除16S marker gene在物種基因組中的copy數目的影響；然后通過每個OTU對應的greengene id，獲得OTU對應的COG家族信息和KEGG Ortholog (KO)信息；并計算各COG的豐度和KO豐度。根據COG數據庫的信息，可以從eggNOG數據庫中解析到各個COG的描述信息，以及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據KEGG數據庫的信息，可以獲得KO、Pathway、EC信息，并能根據OTU豐度計算各功能類別的豐度。此外，針對Pathway，運用PICRUSt可獲得代謝通路的3個水平信息，并分別得到各個水平的豐度表。FUNGuild是一款通過微生態guild對真菌群落進行分類分析的工具，guild是微生態學中的概念，其涉及到一類物種（不管親緣關系相近與否），這些物種能通過相似的途徑利用同類環境資源。FUNGuild基于目前已發表的文獻或權威網站數據，首先根據營養方式將真菌分為3大類：病理營養型（Pathotroph）、共生營養型（Symbiotroph）、腐生營養型（Saprotroph）。基于3大營養方式，又進一步細分為若干個guilds，通過生物信息學方法將真菌物種分類與功能guild分類聯系起來，就可以對真菌進行功能分類。

1.2.5 田間調查

在施藥前對兩個處理隨機各6株樹進行了調查，從8月19日起，之后每7 d施藥一次，共3次。每次施藥后，再次打藥前1 d隨機對每個處理的6株樹進行調查，最后一次調查在8月31日施藥后24 h，每株調查10片葉，共調查4次，并根據葉片病害分級標準，記錄發病情況。0級：葉面無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級：病斑面積占整個葉面積的6%～25%；5級：病斑面積占整個葉面積的26%～50%；7級：病斑面積占整個葉面積的51%～75%；9級：病斑面積占整個葉面積的75%以上。按照下列公式[14]計算病情指數和防治效果：

病情指數=∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)×100

防治效果（%）=(對照病情指數－施藥后處理情指數)/對照病情指數×100

1.3 數據分析

采用SPSS進行數據分析，應用Duncan's新復極差法對田間試驗進行顯著性檢驗，T檢驗法對葡萄葉際微生物相對豐度進行顯著性檢驗，利用上海美吉生物科技有限公司云平臺（https://cloud.majorbio.com）制圖。

2 結果與分析

2.1 混合菌劑處理對葡萄白粉病的防控作用

在整個病害調查期，施藥前CK和SW的白粉病病情指數分別為74和75，施用混合菌劑處理的葡萄白粉病的病情指數顯著降低，尤其在施用第3次藥后下降明顯，降低至30；對照的白粉病病情指數不斷上升，在第3次藥后接近100。在本研究中，混合菌劑對葡萄白粉病防效在第3次藥后達到最高，且隨施藥次數增加呈上升趨勢（圖1）。

圖1 施藥處理后葡萄白粉病病情指數（A）和農藥防治效果（B）Figure 1 Grapevine powdery mildew disease index (A) and pesticide control eあect (B) after application and control treatment

2.2 葡萄葉際微生物樣品測序質量評估

使用農藥混合菌劑和對照處理的葡萄葉際細菌群落總序列數分別為241 092、244 126條，真菌群落總序列數分別為400 657、392 167條，細菌、真菌平均片段長度分別為214、263 bp；按照相似度97%對非重復序列進行聚類后共獲得細菌1016個OUT、真菌188個OUT。葡萄葉際細菌及真菌稀釋曲線顯示，在97%相似度分類水平下，細菌及真菌多樣性稀釋曲線逐漸趨于飽和穩定，表明測序數據量足夠，可以反映葡萄葉際微生物絕大多數物種信息（圖2）。

圖2 葡萄葉際細菌（A）和真菌（B）的Shannon稀釋曲線Figure 2 Shannon dilution curve of grapevine phyllosphere bacteria (A) and fungi (B)

2.3 混合菌劑對葡萄葉際微生物的影響

2.3.1 混合菌劑對葡萄葉際微生物Alpha多樣性的影響

不同處理葡萄葉際微生物的Alpha多樣性指數見表1，施藥處理后葡萄葉際的細菌群落Chao1、Ace豐富度指數分別下降了50.78%、47.97%；Shannon多樣性指數降低1.36，比對照降低48.57%，Simpson多樣性指數增加。說明施用混合菌劑會顯著降低葡萄葉際細菌的多樣性和豐富度。

表1 施用混合菌劑對葡萄葉際微生物多樣性指數的影響Table 1 Eあect of mixture application on grapevine phyllosphere microbial diversity index

施藥后真菌群落Chao1、Ace豐富度指數分別下降了42.80%、53.16%；Shannon多樣性指數增加0.07，Simpson多樣性指數降低。說明施用混合菌劑會顯著降低葡萄葉際真菌的豐富度，而顯著增加了真菌的多樣性（表1）。

2.3.2 混合菌劑對葡萄葉際微生物Beta多樣性的影響

基于Bray-Curtis距離算法在OTU水平和屬水平進行主坐標分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA），如圖3所示，在OTU水平及屬水平上不同處理的葡萄葉際細菌群落均在坐標軸上有明顯距離但又未完全分離，表明兩處理之間細菌群落有部分相同的物種，PC1及PC2在各水平上共解釋了47.36%、80.41%的微生物結構差異。進一步采用非參數檢驗法ANOSIM分析得出，在OTU水平上R=0.32，在屬水平上R=0.25，兩水平上均為P＜0.05，即樣品的組間差異大于組內差異，表明混合菌劑處理后在OTU水平及屬水平上葡萄葉際細菌群落結構差異顯著。

圖3 不同處理葡萄葉際細菌（A＆B）及真菌（C＆D）在OTU水平及屬水平的PCoA分析Figure 3 PCoA analysis of bacteria (A＆B) and fungi (C＆D) in grapevine phyllosphere under diあerent treatments at OTU level and genus level

在OTU水平及屬水平上不同處理的葡萄葉際真菌群落均在坐標軸上完全分離，表明兩處理之間真菌群落有明顯差異，PC1及PC2在各水平上共解釋了66.56%、69.41%的微生物結構差異。進一步采用非參數檢驗法ANOSIM分析得，在OTU水平上R=0.28，在屬水平上R=0.29，兩水平上均為P＜0.05，即樣品的組間差異大于組內差異，表明混合菌劑處理后在OTU水平及屬水平上葡萄葉際真菌群落結構差異顯著。

2.3.3 混合菌劑對葡萄葉際細菌群落結構的影響

在所有測定的對照樣品中，Firmicutes為豐度最高的細菌門，平均相對豐度達60.18%，其次是Proteobacteria（20.13%）、Actinobacteriota（18.03%）、Bacteroidota（1.40%），以上細菌門累計相對豐度為99.74%，在不同處理中存在差異。施藥處理葡萄葉際中的Firmicutes增加了37.48個百分點，Proteobacteria和Bacteroidota消失，Actinobacteriota降低了16.68個百分點（圖4A）。

圖4 不同處理的葡萄葉際細菌門水平（A）及屬水平（B）物種組成Figure 4 Species composition at phylum level (A) and genus level (B) of grapevine phyllosphere bacteria under diあerent treatments

在屬水平上，Bacillus、Pantoea、Stenotrophomonas、Paenibacillus、Curtobacterium、Sanguibacter為對照組葡萄葉際細菌群落中平均相對豐度較高的6個屬，相對豐度分別為51.22%、7.70%、7.42%、6.68%、6.21%、5.62%。施藥后，Bacillus增加46.19個百分點，Pantoea、Stenotrophomonas、Paenibacillus、Curtobacterium、Sanguibacter、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、unclassified_f__Micrococcaceae、Chryseobacterium、Psychrobacillus均消失，其余低豐度細菌類群合并為others，由4.35%降低至2.59%（圖4B）。以上結果表明了施藥影響葡萄葉際細菌類群。

2.3.4 混合菌劑對葡萄葉際真菌群落結構的影響

如圖5所示，在所測定的對照樣品中，Ascomycota為豐度最高的門，平均相對豐度達81.84%；其次是Basidiomycota（17.75%），以上2個真菌門累計相對豐度為99.59%。施藥處理后葡萄葉際中的Ascomycota相對豐度降低了22.85個百分點，Basidiomycota則增加了21.9個百分點。

圖5 不同處理的葡萄葉際真菌門水平（A）及屬水平（B）物種組成Figure 5 Species composition at phylum level (A) and genus level (B) of grapevine phyllosphere fungi under diあerent treatments

在屬水平上，Vishniacozyma、Cladosporium、Filobasidium、Coprinellus、Erysiphe為葡萄葉際真菌群落中相對豐度較高的5個屬，平均相對豐度分別為38.07%、26.18%、8.94%，7.18%、4.55%；施藥后，Vishniacozyma、Cladosporium、Filobasidium、Coprinellus分別降低了9.17、22.39、7.66、7.18個百分點，Erysiphe、Aspergillus、Mortierella分別增加了34.13、9.62、1.04個百分點，其余低豐度真菌類群合并為others，由11.90%降低至11.81%，Coprinellus、Cercospora、Sarocladium施藥后消失。以上結果表明了施藥影響葡萄葉際真菌類群。

2.4 混合菌劑對葉際微生物功能的影響

采用PICRUSt2模塊對葡萄樣品進行微生物群落功能預測，在16S擴增子及ITS測序結果中，主要評估了415條和74條MetaCyc途徑，對兩組樣品進行比較，以P＜0.05、倍數變化（FC）＞3為條件進行篩選，共得到49條相關途徑。其中有2條途徑顯著上調（圖6A），分別為嘌呤核苷酸降解II（需氧，P166）、Beta-D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖醛酸降解超級通道（P231）；47條相關途徑顯著下調，其中真菌參與的僅有1條下調，為5-氨基咪唑核糖核苷酸的生物合成途徑I（P72，圖6B）。選擇FC值前15顯著下調的途徑進行分析（圖6C），主要與葡萄的霉菌酸酯生物合成（P206）、嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成III（P212）、磷酸吡哆醛生物合成通道及修復（P233）、光呼吸（P237）、丙酮酸發酵（P247）、葉綠素a生物合成（P270）、苯乙酸降解I（好氧，P276）、嘌呤堿基降解I（厭氧，P283）、苯乙胺降解途徑（P287）、ADP-L-甘油-&β-D-甘露基庚糖生物合成（P288）、噻唑生物合成I（P290）、脂質生物合成通路（P291）、維生素E生物合成（生育酚，P335）、甘油降解（P208）、2-硝基苯甲酸降解有關（P286）。

圖6 微生物群落參與的MetaCyc途徑變化Figure 6 Changes of metacyc pathway involved in microbial community

3 討論與結論

目前國內外關于混合菌劑對葡萄白粉病防效的研究報道較少，多為單一菌劑對葡萄白粉病的防效研究[15]。在本研究中，混合菌劑對葡萄白粉病表現出了良好的防效，尤其在施用第3次藥后防效明顯，解淀粉芽孢桿菌在一定程度上可控制葡萄白粉病，腈菌唑具有較好的持效期，結合吡唑醚菌酯的殺菌廣譜特性[17]，能有效控制白粉病的發病程度。

植物葉際存在著大量微生物。微生物的多樣性越高，對葉際微生物群落結構協調作用越強，葉際微生態系統越穩定[18]。使用混合菌劑防治葡萄白粉病的同時也會影響葡萄葉際微生物群落結構及多樣性，降低有害菌的比例。在本研究中，經過混合菌劑處理后的葡萄葉際微生物多樣性降低，葉際微生物的Chao1豐富度指數明顯降低。但在細菌和真菌多樣性上的影響不同，表現為細菌Shannon指數降低，而真菌Shannon指數增加，這可能是由于混合菌劑中含有的生防菌劑可作為一些有益菌的營養來源，導致一些微生物相對豐度增加，代表組間差異的PCoA圖在OTU及屬水平上也證明了兩個處理間微生物多樣性有明顯差異。

在本研究中，與對照相比，在門水平上，藥劑處理的優勢細菌門為Firmicutes、Actinobacteriota，優勢真菌門為Ascomycota和Basidiomycota；在屬水平上，藥劑處理后，相對豐度顯著增加的細菌有Bacillus，真菌有Erysiphe和Aspergillus。在主要微生物菌群內，部分微生物可以通過植物及其他微生物之間的相互作用及自身豐度來影響群落結構，并在協調寄主與微生物互作中起到重要作用[19-20]。通過微生物功能預測模塊分析發現，施用混合菌劑后顯著降低了與葡萄磷酸吡哆醛生物合成、光呼吸、丙酮酸發酵、葉綠素a生物合成、苯乙酸降解I、維生素合成等途徑相關的微生物數量，增加了與葡萄嘌呤核苷酸降解II（需氧）、Beta-D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖醛酸降解途徑相關的微生物數量，說明藥劑處理后會引起葉際微生物菌群變化，而進一步影響植物某些功能及生物合成[21-25]。

施用混合菌劑農藥能有效防控葡萄白粉病的發生，但會對葡萄葉際微生物多樣性及物種豐度造成一定影響，混合菌劑中的殺菌劑能直接殺死一些微生物，而混合菌劑中的微生物菌劑能增加某些微生物數量，更好地調節葉際微生物群落的平衡，建議云南相似葡萄基地采用混配方式施用農藥，更有利于維護葡萄質量和微生物區系的穩定。具體農藥最適濃度、頻次以及顯著變化的菌屬是否與植物某些功能及生物合成有關還需要進一步深入研究。