葡萄響應鹽脅迫的研究進展

牛帥科，董宣，趙艷卓，陳展，宣立鋒，張志超，楊麗麗，王廣海*

（1.河北省農林科學院石家莊果樹研究所，河北石家莊 050064；2.中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北秦皇島 066600)

據報道，全球超過20%的農業用地受鹽脅迫危害[1]。2019年聯合國糧食及農業組織（FAO）報告顯示，我國的鹽堿地約有1億公頃[2]，主要位于東北、西北、華北和長江中上游地區[3]，而這些地區恰好是我國葡萄的主栽區域。此外，由于環境的逐漸惡化，加上灌溉水質量不均和不合理施肥等，均加劇了鹽脅迫對葡萄生長的影響。當葡萄面臨鹽脅迫時，會因滲透勢提高，使植株水分吸收受到抑制，加上Na+、Mg2+、Cl-等過高積累引起的離子毒性[4-5]，最終影響葡萄的產量與品質。因此，本文探討了葡萄對鹽脅迫的響應，綜述近年來此方面的研究進展，以期為葡萄抗鹽栽培技術開發和耐鹽品種選育提供理論依據。

1 鹽脅迫對葡萄生長發育的影響

由于葡萄根系直接與土壤接觸，當發生鹽脅迫時，根系首先感知脅迫信號，表現為根細胞膜的通透性增加，滲透勢降低，根系活性降低，在這一過程中還會伴隨自身能量物質的消耗[6-7]。當鹽脅迫超過一定閾值后，會進一步抑制地上部的生長[8]。研究發現，葡萄的根冠比與鹽脅迫程度呈負相關，說明葡萄根系相較于地上部分對鹽脅迫更加敏感[9]。同時發現，降低根組織密度可以減少呼吸作用和養分需求，降低維持代謝的能量，提高根表面積/根干質量的比值（Specific Root Area，SRA），所以，SRA往往用來衡量鹽脅迫對根系的影響程度[10]。前人研究表明，鹽脅迫顯著提升葡萄、橄欖及圣柳等[9-11]植物的SRA值。此外，根系可以通過調節細胞結構響應鹽脅迫過程，當發生鹽脅迫時，植物根系表皮的木栓化程度增加，形成疏水性屏障，從而降低離子和水分吸收[12]。如轉錄因子WRKY9能夠調控CYP94B3和CYP86B1的表達，提高根部木栓化程度，進而增強擬南芥對鹽脅迫的耐受性[13]。楊雪等[14]研究發現，鹽脅迫能夠誘導‘克瑞森無核’和‘1103P’葡萄組培苗根部栓質層厚度增加。

鹽脅迫往往會影響葡萄葉片的組織結構。葉綠體是進行光合作用的主要場所，其完整性是保障葡萄葉片能夠正常進行光合作用的關鍵因素。由于葉綠體對鹽脅迫極其敏感，當葡萄面臨鹽脅迫時，會抑制葉綠體色素合成酶的活性，使葉綠體膜系統受損，加快葉綠素的分解，從而影響葉綠體功能，因此，葉片中葉綠素含量能夠體現葡萄遭受鹽脅迫的損害程度[8]。秦嶺等[15]研究發現，鹽脅迫導致葡萄葉片的表皮細胞、柵欄組織與海綿組織的厚度增加，使類囊體腫脹，葉綠素含量降低。李學孚等[16]發現，隨著鹽脅迫程度的增強，‘鄞紅’葡萄葉片的柵欄組織形狀逐漸不規則，海綿組織與柵欄組織細胞數量降低，且細胞間隙增大，葉綠體結構異常，葉綠素含量隨脅迫程度增強而降低。

近幾年來圍繞鹽脅迫對葡萄果實品質的影響開展了一系列研究。孫紅等[17]利用不同濃度的NaCl對葡萄葉片進行噴施后發現，中濃度（50 mmol?L-1）處理后果實的可溶性固形物與花青素含量明顯提高，高濃度（100 mmol?L-1）則不利于可溶性固形物和花青素的積累，同時證明了無論何種程度的鹽脅迫均不利于果實芳香物質的積累。對局部根系進行適度NaCl處理后能夠顯著提高葡萄果實可溶性固形物含量，降低可滴定酸含量，并提高果實中香氣物質的種類與濃度[18]。趙攀等[19]對‘赤霞珠’果穗噴施NaCl后發現，鹽處理會抑制果實的成熟，不利于果實品質的提高。孫洋等[20]利用0.3%的NaCl溶液對轉色期的‘摩爾多瓦’葡萄進行灌溉處理后發現，鹽處理提高了果實的可溶性固形物及可滴定酸含量，降低了花青素的積累。以上研究表明，合理利用鹽脅迫能夠在一定程度上提高葡萄果實的品質。

2 鹽脅迫對葡萄生理生化的影響

2.1 鹽脅迫對光合作用的影響

在植物面臨鹽脅迫時，往往通過氣孔或非氣孔因素抑制葉片的光合作用。當葉片的凈光合速率、胞間CO2濃度、光化學猝滅系數等指標隨著氣孔導度的降低而降低時，主要為氣孔因素導致；而當胞間CO2濃度先降后升、非光化學猝滅系數逐漸升高，但光合速率降低時，轉變為非氣孔因素，此時的鹽脅迫會降解光系統PSII反應中心的放氧復合體，損傷葉綠體，抑制葉片光合作用的電子傳遞過程[21-22]。研究發現，隨著鹽脅迫程度增加，‘鄞紅’葡萄葉片的氣孔導度、凈光合速率顯著降低，且呈線性關系，在脅迫后期胞間CO2濃度升高，推測這主要為非氣孔因素導致[16]。

2.2 鹽脅迫對離子平衡的影響

一般情況下鹽脅迫往往是由土壤中Na+及Cl-的過量積累所引發[23]，Na+與K+可以通過相同的轉運體進入植物細胞，導致兩者形成競爭關系[24]。K+在植物體內發揮多種功能，如參與滲透調節、蛋白質合成、調節酶活性、維持細胞膨壓和保障光合作用，因此，維持細胞內Na+、K+平衡是決定植物在鹽脅迫下生存能力的關鍵因素[25]。Lupo等[9]利用NaCl對‘SO4’‘瑞克特’‘1103P’砧木進行處理后發現，葡萄葉片中Na+含量顯著低于Cl-，而在根中這種差異并不明顯，認為根與莖中的Na+貯存能力是葡萄耐受鹽脅迫的關鍵因素，正因如此，葡萄葉片中的Na+/K+值不適合作為評判耐受鹽脅迫指標，但根系Na+/K+值可作為長期鹽脅迫下葡萄的耐鹽性指標。

2.3 鹽脅迫對葡萄活性氧（ROS）的影響

由于鹽脅迫提高了細胞的滲透勢，及Na+、Cl-等的過量積累，這就會增加植物體內ROS含量。ROS可以作為信號分子發揮作用，但過量的ROS會引發氧化脅迫，破壞蛋白質、DNA和細胞脂質等生物大分子物質，從而對植物細胞造成損傷[26]。在這一過程中，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化產物，其含量能夠體現植株的損傷程度[27]。為了平衡ROS造成的危害，葡萄能夠通過體內的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等物質清除過量的ROS[28]。付晴晴等[29]對盆栽砧木苗進行100 mmol?L-1NaCl脅迫處理發現，A34具有較強的耐鹽性，其根系活力降低幅度以及O2產生速率、H2O2和MDA含量的升高幅度均較小，鹽脅迫后的抗氧化酶活性表現快速升高然后小幅降低的趨勢。Aazami等[30]發現，利用殼聚糖基水楊酸納米復合材料對土壤進行處理后，能夠顯著降低葡萄在鹽脅迫下MDA含量，并顯著提高SOD、POD、CAT及APX等的活性，進而提高葡萄對鹽脅迫的耐受性。除酶類物質外，一些代謝產物也具有清除ROS的能力。研究表明，鹽脅迫能夠誘導植物花青素的積累，增強對ROS的清除能力，進而降低其對鹽脅迫的敏感性[31]。Souid等[32]研究表明，鹽脅迫能夠促進葡萄白藜蘆醇及其衍生物的合成，從而提高抗氧化能力。

2.4 鹽脅迫對葡萄激素的影響

植物激素如赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）、乙烯（Eth）、油菜素內酯（BR）等在植物不同發育階段、不同組織或環境條件下發揮復雜且高效的作用[33-34]，植物能夠通過調控多種激素的合成、運輸和代謝過程應答鹽脅迫[35]。

鹽脅迫誘導植物ABA的合成，而ABA具有調節葉片氣孔的關閉、抑制植物側根的形成、參與葡萄萌芽、加速果實成熟、促進胞內保護性蛋白的合成等多種功能[36-38]。Upreti等[39]發現，鹽脅迫提高了葡萄砧木中ABA的合成，并且不同砧木的抗鹽能力與體內ABA合成能力成正比。ABA往往通過受體蛋白PYR/PYL的介導，誘導一系列含有ABA響應原件（ABRE）的基因表達來抵抗鹽脅迫[40]。如VaPYL4能夠提高轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性[41]。

鹽脅迫抑制根系的生長與生長素合成減少相關[42]。生長素通過受體蛋白Transport Inhibitor Response 1（TIR1）和Auxin Signalling F-box（AFB）的介導與轉錄抑制因子Auxin/Indoleacetic acid（AUX/IAA）發生互作，形成SCFTIR1/AFB復合體，將其泛素化并降解，解除對Auxin Response Factors（ARFs）的抑制作用，激活由生長素誘導的基因表達，進而調節植物的生長發育與脅迫響應過程[43]。研究發現，鹽脅迫會下調TIR1和AFB2的表達[44]。tir1、afb2突變體提高了擬南芥對鹽脅迫的耐受性，推測生長素合成的減少，減緩了在鹽脅迫下的根系生長，可能是植物適應鹽脅迫的重要機制[45]。

研究表明鹽脅迫會增強植物茉莉酸（JA）的積累，而JA能夠直接或間接調控如蔗糖轉化酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶、精氨酸脫羧酶及抗氧化酶等酶類的活性，來響應鹽脅迫過程[12]。作為JA信號的受體Coronatine Insensitive 1（COI1）通過結合Jasmonate ZIM-domain（JAZ）蛋白，使其泛素化并被降解，釋放與JAZ結合的一些轉錄因子活性，從而激活響應JA信號基因的表達[46]。Ismail等[47]研究發現，外源施加JA可以緩解鹽脅迫對葡萄細胞生長的抑制作用，葡萄中JAZ1-3基因的表達隨著鹽脅迫程度增加，呈現先升高后降低的趨勢。應用茉莉酸甲酯（MeJA）能夠增強鹽脅迫下葡萄的CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、APX活性，降低葉片中Na+與Cl-含量，提高葡萄對鹽脅迫的耐受性[48]。

除此之外，鹽脅迫提高了植物中乙烯、水楊酸的積累。乙烯、水楊酸通過調控細胞膜滲透性，維持體內離子平衡，增強抗氧化酶的活性；鹽脅迫降低了細胞分裂素、赤霉素的含量，從而提高植物對鹽脅迫的耐受性[12,35,49]。

3 葡萄響應鹽脅迫的分子機制研究

當葡萄面臨鹽脅迫時，分子水平調節是較為基礎且關鍵的步驟，探索葡萄鹽脅迫狀態下的分子調控機制，能夠為揭示葡萄耐鹽機理提供堅實的理論依據，為耐鹽品種的選育提供候選基因。近年來許多研究人員通過轉錄組測序技術挖掘出很多葡萄應答鹽脅迫的基因，如Upadhyay等[50]對鹽脅迫下‘無核白’的葉片進行測序，挖掘出343個差異性表達的基因。Guan等[51]分析發現，鹽脅迫下葡萄葉片中差異表達基因與抗逆防御代謝途徑相關，如ROS清除、離子運輸、熱激蛋白、病程相關蛋白、激素信號等。Daldoul等[52]通過對野生葡萄根的生理指標與轉錄組進行檢測發現，在鹽脅迫前期，主要以糖酵解代謝和類黃酮生物合成等非酶類物質響應ROS的積累，隨著鹽脅迫時間增加，主要影響木質素、異黃酮、單萜、熱激蛋白、半乳糖、淀粉等物質合成和抗氧化酶類系統。

迄今為止，在葡萄中已經挖掘出許多響應鹽脅迫的轉錄因子。如VvMYC2[53]提高了轉基因擬南芥在鹽脅迫下的萌發率。通過提高SOD、POD、CAT等抗氧化酶類活性，VvWRKY2[54]、VlWRKY3[55]、VvWRKY30[56]、VvNAC17[57]提高了轉基因煙草或擬南芥對鹽脅迫的耐受性。轉VvWRKY28提高了擬南芥在鹽脅迫下ABA信號通路關鍵基因NCED3和SnRK2.4、抗氧化酶基因CAT2和SOD1、脯氨酸合成關鍵基因P5CS1及SOS途徑中SOS2的表達，進而提高了擬南芥在鹽脅迫下的存活率[58]。鹽脅迫下，過表達VvMYB62降低了擬南芥葉片中的Na+/K+，增強植株耐鹽性[59]。葡萄生長素原初響應基因VvIAA18，增強了煙草中應答鹽脅迫關鍵基因的表達與抗氧化酶類物質活性，提高了煙草對鹽脅迫的耐受性[60]。

除轉錄因子外，葡萄中通過不同途徑來響應鹽脅迫的基因逐漸被挖掘。過表達VvSNAT1增強了擬南芥褪黑素合成和ROS清除能力，進而提高對鹽脅迫的耐受性[61]。通過調節離子轉運體及通道、滲透調節物質的積累和膜穩定性，VvKCS11提高了擬南芥的耐鹽性[62]。鹽超敏感（Salt Overly Sensitive，SOS）信號轉導途徑是經典的抗鹽信號通路，通過該途徑的調節能夠阻止細胞內Na+的過度積累，SOS3是啟動該通路的關鍵蛋白，Ma等[63]對葡萄中SOS3家族的9個基因進行了鑒定，并發現在葡萄根、莖或葉片中SOS3家族基因受鹽脅迫的誘導絕大部分上調表達。葡萄芪合酶VvSTS36在ABA信號介導下及對ROS的調控下，提高了擬南芥對鹽脅迫的耐受性[64]。通過可變剪接形式改變VvPMA1的N端長度，能夠調節葡萄根質膜的H+-ATP酶活性，從而響應鹽脅迫[65]。

4 緩解葡萄鹽脅迫的栽培技術研究

為了應對鹽脅迫，在葡萄生產過程中使用對鹽脅迫高抗的砧木是目前最有效、最直接的應對方式，因此，對于耐鹽砧木的篩選已成為重點研究方向之一。此外，近年來還研發出許多緩解葡萄鹽害的其他栽培措施。研究發現，工程納米顆粒是一種具有獨特物理化學特性的超小顆粒，合理使用能夠提高農業投入品（如肥料、殺蟲劑、生長調節劑等）功效[66]，有效緩解鹽脅迫對植物的危害。在鹽脅迫下，特定的工程納米顆?？梢詳y帶相應化合物或營養物質，通過增強植物調節自身生理活動提高耐鹽性。Li等[67]利用90 μg?mL-1多壁納米碳管溶液對葡萄幼苗進行處理，明顯降低幼苗葉片MDA含量，并提升SOD、POD、CAT、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate Reductase, DHAR）、APX等抗氧化酶類活性，提高葡萄對鹽脅迫耐受性。另外，有報道表明，應用氧化石墨烯負載脯氨酸衍生物、殼聚糖基水楊酸、腐胺-碳量子點及氧化鈰等[68-70,30]納米復合材料均能夠提高葡萄的抗氧化能力，增強葡萄對鹽脅迫的耐受性。除納米材料外，還有許多方式被證明能夠緩解鹽脅迫對葡萄的危害，Soylemezoglu等[71]研究發現，Si能夠降低鹽脅迫下‘1103P’葉片中Na+含量。Liu等[72]將含有鹽分的灌溉水進行磁化處理后，能夠顯著提高葡萄葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，提高凈光合速率、氣孔導度及蒸騰速率。王淥等[73]發現，磁化水能夠有效緩解鹽脅迫對葡萄莖、葉生長的抑制作用。

5 展望

近年來土壤鹽堿化的面積與程度持續增加，已成為影響葡萄產業發展的重要問題之一。培育耐鹽品種，篩選耐鹽砧木，研發緩解鹽脅迫栽培技術是解決這一問題的主要手段。

目前，對葡萄耐鹽機理的研究尚不充分，在分子水平，需要進一步解析耐鹽基因的作用機制與調控通路，開發葡萄中耐鹽基因的分子標記，為葡萄抗鹽品種的選育提供候選基因及分子標記輔助育種手段。在生理層面，需要對葡萄在鹽脅迫過程中的調節機制（如激素調節、離子調節、抗氧化調節等）進行綜合并深入探討，充分把握葡萄響應鹽脅迫的規律，從而完善篩選抗鹽葡萄品種的評判體系，以及作為改良和創新緩解葡萄鹽脅迫栽培技術的理論基礎。