浸漬方式對高海拔‘赤霞珠’葡萄酒揮發性風味物質的影響

梅源，蘇周晨星，譚立杭，郭賓，索雨潔，段冰冰，閆銀芳，劉旭*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川成都 610011；3.香格里拉酒業股份有限公司，云南迪慶 674400；4.五糧液仙林生態酒業有限公司，四川宜賓 644007）

生態條件是釀酒葡萄品質形成的重要基礎[1]。在全球氣候變化的大背景下，氣溫升高、紫外輻射增強以及水資源短缺等問題突出，顯著影響了傳統葡萄酒產區葡萄生長發育的物候期和生理生化特性，進而影響了葡萄酒品質[2-4]。為應對氣候變化帶來的影響，釀酒葡萄栽培常通過調節果際微氣候來提高果實品質[5]，此外國內外酒莊還積極尋找更高海拔的葡萄酒產區。因為高海拔地區的平均氣溫普遍低于傳統葡萄酒產區，且晝夜溫差更大、光合有效輻射更強，有助于葡萄果實中積累更多的揮發性香氣化合物和黃酮類次生代謝產物，這既能提高高海拔地區葡萄果實的抗逆性，又有利于獲得優質的釀酒原料[6]。

有研究發現，海拔高度會影響葡萄果實中香氣物質的積累[7]，進而造成葡萄酒中風味化合物種類、含量的變化，以及風味輪廓的差異[8]。Falc?o等[9]對比了不同海拔葡萄園釀造的‘赤霞珠’葡萄酒風味物質差異發現，2-甲氧基-3-異丁基吡嗪類物質與海拔具有顯著相關性，且葡萄酒呈現更濃郁的“甜椒”氣味。Yue等[10]對云南高原5個不同海拔地區‘赤霞珠’葡萄酒的香氣特征進行了研究發現，隨著海拔升高，葡萄酒總揮發物的數量逐漸增加但濃度降低。此外，針對不同葡萄品種及所釀葡萄酒的酚類物質、抗氧化活性和感官質量特征等方面也有相關報道[7,11]。Berli等[12]研究發現，葡萄漿果比表面積隨著海拔高度的增加而降低，從而有利于提高葡萄浸漬發酵過程中酚類物質和香氣物質的可提取率。因此，高海拔葡萄酒往往呈現出更加突出的香氣和口感[13]。

除了葡萄品種、生態條件、栽培管理和陳釀措施等因素外，浸漬工藝對葡萄酒最終的風味品質形成也至關重要[14]。尤其是當葡萄原料成熟度好，酚類物質、花色苷及優質單寧等含量充足時，采用加強浸漬工藝更有利于釀造出風味濃郁的高品質葡萄酒[15]。針對于此，前人研究了不同浸漬工藝對常見海拔地區葡萄酒品質的影響[14,16]。張娟等[17]探究了葡萄酒發酵結束后延長浸漬時間對葡萄酒香氣和品質的影響，發現隨著浸漬時間的延長葡萄酒的香氣成分含量增加，且具有更濃郁的果香和植物香氣。周繼亙等[18]對比了多種浸漬工藝條件對葡萄酒香氣物質的影響，發現冷浸漬工藝下酒樣香氣物質種類更多，且具有更好的感官特性。上述報道多針對單一的海拔高度因素或釀造工藝來研究其對葡萄酒風味及品質的影響，但在探索不同浸漬工藝對高海拔葡萄酒品質尤其是香氣品質相關影響的研究卻鮮有報道。

因此，本研究對我國西南高山產區高海拔‘赤霞珠’葡萄原料采用常規浸漬發酵、發酵前冷浸漬和發酵后延長浸漬3種方式，對所釀葡萄酒揮發性香氣物質進行了測定，采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）和香氣活度值（OAV）等方法解析了3種浸漬工藝下葡萄酒風味的差異和特征物質，并結合感官評價探明了不同浸漬工藝對高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香氣品質的影響，以期為高海拔地區優質葡萄酒釀造工藝的優化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料及試劑

試材為11年生‘赤霞珠’葡萄，2022年于商業采收期（9月25日）采自四川省甘孜藏族自治州得榮縣日雨鎮因都壩二號壩葡萄園（28°37’N，99°11’E），海拔2775 m，采用常規田間管理。

無水乙醇、酒石酸、氯化鈉（均為分析純），西安化學試劑站。超純水由純水制備儀Milli-Q（美國Millipore公司）制備。4-甲基-2-戊醇等香氣成分標準品，Sigma-Aldrich公司（北京分部）。

1.2 儀器與設備

Lyza 5000 Wine全自動分析儀，安東帕有限公司（奧地利）；UV-1780紫外分光光度計，島津儀器公司（蘇州分部）；固相微萃取裝置（SPME，Supelco，Bellefonte PA，美國），配聯用手柄57330-U，萃取纖維50/30 μm DVB/CAR/PDMS；島津QP2020氣相色譜質譜聯用儀（島津，日本），色譜柱為毛細管柱DBWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W，美國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造

參考干紅葡萄酒小容器釀造規范[19]，略有修改。每個處理隨機選取成熟度良好、健康無病的葡萄漿果20 kg。除梗破碎后，加入50 mg?L-1焦亞硫酸，倒入20 L玻璃發酵罐后，采用以下3種方式進行浸漬發酵：

常規浸漬（NM）：入罐后的葡萄醪立即加入20 mg?L-1果膠酶（Lallzyme Ex，法國）和200 mg?L-1酵母菌（Lallemand，法國），啟動酒精發酵，每天壓帽3次。酒精發酵結束后立即進行皮渣分離，在酒液中加入50 mg?L-1焦亞硫酸，于4 ℃冷庫中澄清1個月，期間倒罐3次，去除酒泥，再將新酒封存于4 ℃冷庫中貯藏3個月，待后續指標測定及感官評價。

發酵前冷浸漬（Pr-M）：將干冰加入發酵罐，使葡萄醪的溫度降至4 ℃，保持冷浸漬7 d，待葡萄醪回溫至12 ℃后加入20 mg?L-1果膠酶和200 mg?L-1酵母，啟動酒精發酵。后續管理同NM。

發酵后延長浸漬（Po-M）：常規浸漬發酵結束后，繼續每天壓帽3次，保持葡萄皮渣被酒液持續浸漬7 d后，期間加入適量干冰使葡萄醪溫度控制在18 ℃左右。浸漬結束后進行皮渣分離，后續管理同NM。

1.3.2 基本理化指標及酚類物質含量測定

采用葡萄酒全自動分析儀對不同處理下釀造所得葡萄酒的pH、酒精度、含糖量、可滴定酸含量等基本理化指標進行測定。總酚含量的測定采用福林-肖卡法，結果以沒食子酸計；總單寧含量的測定采用甲基纖維素沉淀法（MCP）[20]，結果以兒茶素計；總花色苷含量的測定參考翦祎等[21]的方法進行，結果以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷計。

1.3.3 揮發性風味物質測定

采用頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯用技術（HS-SPME-GC/MS）進行測定。依次取葡萄酒樣品5.0 mL、氯化鈉1.0 g和4-甲基-2-戊醇內標溶液10 μL，置于20 mL頂空瓶中用于GC-MS分析；GC-MS設定條件參考李愛華等[22]的方法。測定所得結果經NIST14.L譜庫檢索，對其中匹配度大于750的物質進行定性分析。采用濃度為1.0 μg?L-1的4-甲基-2-戊醇為內標進行相對定量，揮發性風味物質相對濃度的計算參考畢蕓杰[23]的方法。

1.3.4 感官評價

參考楊潔等[24]的方法對感官品評員進行訓練，經考核篩選后組建感官品評小組。小組成員共20人，男女比例1∶1，由年齡在18～25歲的西北農林科技大學葡萄酒學院本科生及研究生組成。采用線性標度法[25]（0～10 cm）對酒樣風味描述詞的感官特性進行強度上的定量描述分析。

1.4 數據處理與統計分析

采用SPSS 26.0對數據進行方差分析、多重比較（Duncan，P≤0.05）；采用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘回歸分析（PLSDA）。

2 結果與分析

2.1 浸漬方式對高海拔葡萄酒理化指標的影響

由表1可知，Po-M處理組酒樣可滴定酸含量顯著高于NM和Pr-M組，pH則顯著低于其他兩個處理。3個處理間酒樣揮發性酸含量無顯著性差異。不同浸漬方式下葡萄酒的酒精度均較高，為15.06%～15.64%（Vol，下同）。Po-M處理酒樣的殘糖含量顯著高于其他兩個處理，3種浸漬方式下酒樣的殘糖含量為2.51～2.70 g?L-1，表明所有酒樣均為發酵完全的干型葡萄酒。總體而言，3種浸漬方式下的葡萄酒樣均符合GB 15037—2006《葡萄酒》的相關要求。Po-M酒樣的總酚含量為3.24 g?L-1，顯著高于NM和Pr-M，而后兩者間無顯著性差異。3種浸漬方式下酒樣的總花色苷和總單寧含量均無顯著差異。

2.2 浸漬方式對高海拔葡萄酒揮發性風味物質影響

2.2.1 揮發性風味物質含量分析

利用HS-SPME-GC/MS方法得到的揮發性化合物，通過譜庫檢索共鑒定出73種物質，包括酯類34種、醇類30種、酸類4種、醛酮類4種、酚類1種（表2），其中在NM、Pr-M和Po-M處理酒樣中分別鑒定出59、61、51種揮發性風味物質。由表2可知，3種浸漬方式的酒樣中醇類和酯類物質的相對含量最高，總含量分別為602 851～652 904 μg?L-1和79 711～88 266 μg?L-1。此外，盡管各處理酒樣的醇類和酯類物質總含量差異較小，但在種類上存在一定的差異。其中，NM處理酒樣的醇類物質種類最多（27種），高于Pr-M（24種）和Po-M處理（20種）。而Pr-M處理酒樣的酯類物質種類最多（29種），高于Po-M（25種）和NM處理（25種）。

表2 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒揮發性風味物質的含量Table 2 Volatile aroma compounds content of high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

為了明確不同浸漬方式下高海拔葡萄酒揮發性化合物的整體概況以及所鑒定出的化合物是否具有代表性，以不同物質的相對含量為X變量，不同浸漬方式為Y變量進行無監督的PCA分析。由圖1可知，PC1和PC2累計解釋所有變量的86.1%，可以表示所有樣品的大部分信息。不同浸漬方式下葡萄酒揮發性風味物質在組成上具有較好的區分度，說明不同處理酒樣揮發性物質的差異較大。其中Pr-M和Po-M處理分別與第一主成分呈現出負相關和正相關，且均與第二主成分呈負相關；NM處理主要與第二主成分呈正相關，這表明常規浸漬處理的酒樣與增強浸漬（Pr-M和Po-M）后的酒樣主要在第二主成分上存在差異。

圖1 不同浸漬方式下高海拔葡萄酒揮發性風味物質PCA分析Figure1 PCA analysis of volatilearoma compounds in high-altitudewinesunder diあerentmacerationmethods

2.2.2 主要差異性和風味貢獻化合物分析

為了進一步明確不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒樣中具有差異性的主要揮發性風味化合物，對NM、Pr-M和Po-M處理下酒樣中檢測到的73種揮發性風味物質進行偏最小二乘判別分析，交叉驗證R2為0.584，Q2為-0.029，表明模型未過擬合[26]，且PLS-DA模型的R2X為0.995，R2Y為0.998，Q2為0.993，表明模型穩定可靠[27]。PLS-DA分析雙標圖（圖2A）中從大到小的橢圓分別表示置信度為100%、75%和50%。在模型中鑒定出9種VIP>1.0的差異貢獻化合物（圖2B），大部分為醇類化合物；其中1-戊醇（A38）與第二主成分呈現正相關，是NM處理相對Pr-M和Po-M處理下的主要差異化合物。另外，異戊醇（A37）、正己醇（A42）、苯乙醇（A60）和正丁醇（A36）等化合物與第一主成分呈負相關，是Pr-M處理酒樣中的主要差異性風味物質；而乙酸乙酯（A1）、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇（A48）、己酸（A65）和苯甲醇（A59）等風味化合物則與Po-M處理密切相關。結合圖2A的結果表明，盡管大多數風味化合物與Pr-M處理酒樣具有更強的相關性，但在主要差異化合物中具有代表性的風味物質數量與Po-M處理相同，且均高于NM處理。在加強浸漬處理中，Po-M處理酒樣的主要差異化合物除了醇類化合物外還包括酯類和酸類化合物，因此在風味物質組成上較Pr-M酒樣更加豐富。

圖2 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒揮發性風味物質PLS-DA分析Figure 2 PLS-DA analysis of volatile aroma compounds in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wines under diあerent maceration methods

香氣活度值（OAV）是評價某單一香氣化合物對食品整體香氣貢獻程度的指標[28]，尤其當OAV＞1時，表明該物質含量超過了人體感官閾值，是評估其對葡萄酒風味貢獻的重要指標。3種不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV＞1的主要物質包括13種化合物（表3）。其中酯類化合物7種，醇類物質4種，酸類物質2種；OAV值最高的化合物為呈果香的異戊酸乙酯，其次是呈甜果香和草莓香的2-甲基丁酸乙酯，第三是呈現脂肪氣味的己酸。盡管大多數酯類化合物在PLS-DA分析中并非差異化合物，但其含量對不同浸漬方式下葡萄酒的風味輪廓差異仍具有一定影響，尤其是OAV值較高的幾種酯類物質中Po-M處理的最高，這表明Po-M處理酒樣可能具有更多的果香特征。再結合VIP＞1的化合物發現，作為Pr-M處理酒樣主要差異貢獻物的異戊醇、正己醇和苯乙醇可能使Pr-M酒樣呈現更多的花香和植物香氣。然而NM處理酒樣中，這些化合物的OAV值與其他處理的酒樣相比，均位于中間值或最低值，表明NM處理下葡萄酒的花果香和植物香等香味強度低于增強浸漬處理后的樣品。

表3 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV>1的揮發性風味物質Table 3 Volatile aroma compounds with OAV> 1 in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

2.3 不同浸漬方式對高海拔葡萄酒感官品質的影響

為明確不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香氣感官特性的差異，感官品評小組對所有處理組酒樣的風味特性進行了定量描述分析。不同的香氣描述詞根據其風味特性分為6類，分別是果香（包括覆盆子、黑醋栗、草莓、香蕉等描述詞）；花香（包括紫羅蘭、玫瑰等描述詞）；植物（包括青椒、薄荷、香草等描述詞）；煙熏、香料（包括煙草、胡椒、桂皮等描述詞）；木頭、堅果（包括橡木、雪松、烤杏仁等描述詞）；脂肪（包括奶油、巧克力等描述詞）。根據不同類別風味強度的得分情況繪制雷達圖（圖3）。NM處理酒樣具有更濃郁的木頭、堅果和脂肪味，而在花果香、植物香和香料等風味的強度上最低。和NM相比，Pr-M處理酒樣的花香和植物香型更強，且具有中等強度的煙熏、香料味。Po-M處理酒樣具有濃郁的果香和煙熏、香料味，以及中等強度的木頭、堅果和脂肪味，而在花香和植物香上強度略低于Pr-M酒樣。不同浸漬方式下葡萄酒風味輪廓的感官分析結果與VIP結合OAV值篩選出的關鍵風味物質基本符合，即酯類化合物如異戊酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等含量較高的Po-M處理酒樣更具果香，醇類物質如正庚醇、苯乙醇等含量較高的Pr-M處理酒樣更具花香和植物香。

圖3 感官分析雷達圖Figure 3 Radar map of sensory analysis

3 討論與結論

香氣是表征葡萄酒感官質量的重要指標之一。由于釀酒葡萄中大多數風味物質及其前體物質主要存在于果皮中[33]，因此在葡萄原料品質較好的情況下常采用加強浸漬的方式來提高葡萄酒風味品質和整體質量。然而，針對不同的葡萄品種和原料品質，采用的加強浸漬方式也各不相同，因此本研究通過頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯用技術對高海拔‘赤霞珠’葡萄在不同浸漬方式下釀造葡萄酒的揮發性風味物質的差異進行了檢測分析。本試驗共鑒定出73種化合物，其中醇類和酯類化合物種類和含量最高，占所有香氣成分含量的98%，與前人的研究結果一致[17-18]。

不同浸漬方式會影響葡萄酒中揮發性物質的種類及含量[34]，發酵前冷浸漬處理葡萄酒中的風味化合物種類最多，較另外兩個處理酒樣的主要差異化合物為醇類物質，如由苯丙氨酸代謝產生的苯乙醇[17]以及正己醇等化合物，其獨特的紫羅蘭、玫瑰香氣和青草味使葡萄酒呈現出更濃郁優雅的花香和植物香氣。這是由于發酵前葡萄醪的冷浸漬有利于提高‘赤霞珠’葡萄酒中糖苷含量[35]，且有利于更多芳香類物質的浸出[18]。另外，本試驗中發酵后延長浸漬處理葡萄酒的風味物質數量較常規浸漬處理更少，但其關鍵差異化合物的組成更加復雜，且葡萄酒風味貢獻化合物中乙酸乙酯及脂肪酸等的含量更高。由于酯類物質是葡萄酒發酵香氣中果香的主要貢獻物質[29]，因此發酵后延長浸漬處理的葡萄酒表現出更濃厚的甜果香，且其中的差異化合物己酸具有的脂肪味也能有效調節葡萄酒風味的平衡性，從而豐富風味結構。值得注意的是，發酵后延長浸漬處理和發酵前冷浸漬一樣可提高葡萄酒風味和品質，且發酵后延長浸漬能有效提高葡萄酒中的酚類化合物含量[14]，使葡萄酒更加飽滿醇厚，并能在一定程度上彌補發酵前期產生的缺陷[17]，提高葡萄酒的整體風味。相比發酵前冷浸漬處理，發酵后延長浸漬處理葡萄酒風味產生的差異可能與其浸漬溫度和浸漬階段有關[36]，且發酵后延長浸漬相比發酵前冷浸漬可能延長了葡萄酒中酯化反應的進程，從而能萃取出更多的酯類物質。感官評價結果表明，增強浸漬處理能顯著提升高海拔‘赤霞珠’葡萄酒的風味品質，尤其是發酵后延長浸漬較發酵前冷浸漬釀造的葡萄酒具有更濃郁的果香和更豐富的風味結構。

綜上所述，以高海拔‘赤霞珠’葡萄為原料，經過加強浸漬處理的葡萄酒較常規浸漬處理具有更豐富的風味物質組成，且貢獻差異的化合物含量更高，發酵后延長浸漬能使葡萄酒呈現出更豐富的香味類型。本研究結果為優化我國高海拔地區葡萄酒釀造工藝，進一步提升高海拔葡萄酒的品質提供了一定的理論和實踐基礎。