藥物注射法建立膝骨性關節炎動物模型研究進展*

錢燦穎 劉 磊,2△

膝骨性關節炎(Knee Osteoarthritis,KOA),又稱為退行性骨關節炎、老年性關節炎等,是臨床上常見的退行性骨關節炎疾病。其主要病理變化是膝關節軟骨的磨損、退變、增生等[1], 60歲以上患者的發病率為50%,75歲以上患者的發病率為65%,致殘率高達53%[2,3]。臨床可表現為慢性進行性發展的膝關節腫脹,疼痛、僵硬,繼發性滑膜炎等,給患者帶來生理上和心理上的雙重損害。

目前中國的老齡化程度加劇,此病的發病率呈顯著上升趨勢,因此開展多途徑治療KOA的作用和機制研究,探索更有效的干預方法,進一步提高此病的治療效果尤為必要。動物實驗研究是開展KOA發病和治療機制探索的重要途徑,然而研究方法不同,所使用的的模型制作各有優缺點,本文就藥物注射法建立KOA動物模型的優勢展開分析,并對相關研究進展進行梳理,以期推動KOA的臨床及研究。

1 實驗動物的選擇

相比臨床研究,采用動物實驗開展疾病的發病和治療機制具有取材檢測便捷、研究周期可控、研究成本較小等優勢。目前臨床研究常用的實驗動物包括大鼠、小鼠等小型動物,以家兔為代表的中體型動物及犬、羊、猴等大型動物。其中小型動物的優勢在于體積小,易抓捕和飼養,但關節較小,實驗操作較為困難。研究表明,以小鼠為KOA實驗模型多用于研究KOA遺傳和分子水平的發病機制,且多使用基因敲除小鼠[4]。大鼠由于自身特殊的解剖結構,軟骨的骨質比較厚,不容易形成自發型KOA,一般多作為誘發型KOA的實驗對象。因此,大鼠廣泛運用于KOA發病機制和不同干預方式對KOA炎癥反應、骨質修復等影響的動物實驗研究[5]。豚鼠的生理結構是其作為自發性KOA模型的一大優勢,如Hartly豚鼠,其內翻的膝關節負重較大,正是KOA的多發部位,且病理表現與人類KOA十分類似,多用于模擬臨床治療和評估[6]。

中、大體型動物具有關節結構易于實驗操作的特點,但所需費用較昂貴,飼養條件要求高。中大型動物模型以犬、羊、猴為主。其體型較大,膝關節的解剖結構與人類的相似度較高,造模方法簡單,但存在著價格高、飼養難度、疾情進展慢、觀察時間長等缺點[7]。

2 動物模型的分類

KOA造模方法一般分為2種:自發性動物造模和誘發性動物造模。自發性動物造模是自然產生的,人類不進行干預;陳松[8]將3個月大的豚鼠喂養2個月后構建了自發性豚鼠KOA模型,并對造模后的豚鼠膝關節做病理切片,發現豚鼠的成骨細胞和成纖維樣滑膜細胞有了明顯的變化。這種造模方法成功率較高,且受外界因素干擾較小。但也存在著造模周期較長,費用成本高的弊端。

另一種是誘發性動物造模,指通過人為干預,注射藥物、手術誘導等產生[9]。相比自發性動物造模,誘發性動物造模能夠更加個性化的根據研究需要復制特定病理過程的模型動物。相比手術造模,藥物注射誘導制作KOA動物模型具有操作簡便、創傷性較小、可控性較好等優勢。目前,在實驗中常用的藥物注射誘導KOA模型的藥劑包括木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉、膠原酶等。

2.1 注射木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶,是一種常用的KOA動物造模方案。通過分解軟骨基質中的蛋白多糖,降低了對軟骨細胞的保護能力,使得軟骨細胞更易被破壞,從而加快KOA的發展[10]。木瓜蛋白酶關節內注射多用于誘導家兔、鼠等動物骨關節炎。何俊君等[11]向兔模型的膝關節腔內注射木瓜蛋白酶,在第1、4、7天注射濃度為4%的木瓜蛋白酶溶液造模,2周后成功造出早期的KOA兔模型。這種造模周期短、成功率高的模型為建立早期KOA模型奠定了基礎。韓冠英等[12]比較了注射2%、5%、10%濃度的木瓜蛋白酶建立的兔KOA動物模型,并于注射后的第2、4、6周對膝關節進行研究實驗,發現KOA的嚴重程度會隨著濃度和時間的增高而增高。不同濃度的木瓜蛋白酶注射用于制備不同嚴重程度的骨關節炎模型,為研究KOA的病理表現和治療方法提供了數據支持。

2.2 注射碘乙酸鈉碘乙酸鈉是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的抑制劑,是臨床上最常用的OA關節腔注射化合物[13],能引發軟骨基質的退行性改變,軟骨的降解和丟失,這些病理變化與人KOA的病理變化較類似。張文強等[14]將0.1 ml 4%碘乙酸鈉溶液50 μl注入大鼠膝關節腔,2周后建模側膝關節出現腫脹及屈伸功能障礙,顯示造模成功。鮑哲明等[15]發現,碘乙酸鈉注射復制動物模型后可見軟骨表面缺損,關節周緣骨贅增生,軟骨下骨密度減低,骨小梁變薄稀疏,組織切片見軟骨結構形態紊亂,局部簇集現象,染色變淺甚至消失,同時認為,碘乙酸鈉造模2周時達到OA中期階段,造模4周時為OA晚期階段。

2.3 注射膠原酶膠原酶是一種金屬蛋白酶,通過分解軟骨間質的膠原蛋白,損傷關節內的肌腱、韌帶和半月板等各型膠原纖維,從而導致膝關節的不穩定,誘導KOA的發生。葛海雅等[16]在實驗第1、4天于大鼠膝關節腔注射0.4 mg/mlⅡ型膠原酶,第7天運用膝關節核磁共振技術進行模型鑒定,確認造模成功。Ad?es等[17]通過在大鼠膝關節內注射膠原酶制作為OA模型,發現膠原酶可誘導OA樣組織病理學改變和運動誘導的傷害感受的發生。Kikuchi等[18]分別將0.5、1.0、2.0 mg的膠原酶注射入成年兔模型的膝關節腔內,經過6周的組織學觀察發現膠原酶的劑量越大,關節軟骨和滑膜的變性程度也越大,且外側的關節軟骨退變程度大于內側。隨著時間加長,滑膜變性開始逐漸緩解。

3 小結

KOA的實驗動物藥物注射種類多樣,各有其特點和適用范圍,注射藥劑的選擇應結合病癥表型和研究觀察指標等實際需要,并做出適應性的考量。藥物注射法實驗操作相對簡單,造模的成功率相對較高,對動物創傷性小,且得到的模型相對穩定,帶有明顯的軟骨破壞,便于組織形態學觀察[19]。不同藥物制劑間各有區別,但從目前的研究來看,關節腔內注射木瓜蛋白酶可引起骨性關節炎急速發生,造模的時間短,可重復性高,是較為經典的一種動物KOA造模方案[20,21]。有報道指出,木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉和Ⅱ型膠原蛋白酶均可致大鼠KOA模型且雌雄組別差異無統計學意義,但碘乙酸鈉模型關節病理特征更為顯著,能造成關節軟骨更嚴重的損傷[22]。木瓜蛋白酶制作的動物模型與早期人體KOA的病理變化類似,且關節軟骨的退行性改變程度隨木瓜蛋白酶濃度和誘導時間呈正相關[23],可用于研究不同病程周期的KOA病變機制和干預治療。碘乙酸鈉可導致動物關節軟骨出現更為顯著的炎性病理變化,但容易造成大量軟骨細胞凋亡,對實驗造成影響[24],此方法造模多用于研究中、晚期骨性關節炎疼痛、檢測治療方法。而膠原酶則更類似于中晚期OA的病變,適合外科關節手術方面的研究[25]。